Cartographie précise du cerveau pour effectuer l’imagerie in vivo répétitive de la dynamique neuro-immune chez les souris

Le système nerveux central (SNC) est régi par un jeu complexe d’interactions entre divers types de cellules résidentes, y compris les neurones, la glia et les cellules associées aux vaisseaux. Traditionnellement, les cellules neuronales ont été étudiées dans des cellules isolées, co-cultivées^1,,2,3,4,5 (in vitro) ou des tissus cérébraux excisés (ex vivo)^6,7,8,9,10 contextes. Cependant, il est nécessaire de mieux comprendre le comportement des cellules neuronales et les interactions dans l’environnement natif du cerveau intact in vivo. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode de cartographie in vivo des régions d’intérêt et de ré-image précise de ces régions dans les futures sessions d’imagerie pour suivre les interactions complexes entre les différents types de cellules du SNC sur de longues périodes de temps.

Le développement d’approches d’imagerie in vivo a fourni des gains significatifs pour la bonne compréhension de la fonction neuronale^{11,12,13,14,15}. Plus précisément, ces approches offrent plusieurs avantages par rapport aux approches traditionnelles in vitro et ex vivo. Tout d’abord, les systèmes d’imagerie in vivo ont des composants cellulaires et tissulaires physiologiquement pertinents tels que la vascularisation avec le répertoire complet des interactions cellulaires pour fournir une compréhension complète de la physiologie du réseau neuronal. Deuxièmement, les résultats récents suggèrent que lorsqu’ils sont retirés de leur environnement natif, certaines cellules neuronales (telles que les microglies) perdent des caractéristiques importantes de leur identité et donc la physiologie^16,17 qui peuvent être préservées dans le cadre in vivo. Troisièmement, les systèmes d’imagerie in vivo offrent la possibilité d’étudier des études longitudinales stables de plusieurs semaines à plusieurs mois pour étudier les interactions cellulaires du SNC. Enfin, compte tenu des preuves croissantes des contributions du système immunitaire périphérique^18,19 et du microbiome^20,21 en physiologie du SNC, les systèmes in vivo fournissent une plate-forme pour interroger ces contributions et effets sur les cellules du SNC. Ainsi, les approches qui utilisent l’imagerie in vivo longitudinale pour étudier la physiologie neuro-immune et les interactions dans les états sains, blessés et malades sont un grand ajout complémentaire aux approches traditionnelles.

Dans ce protocole, nous décrivons une approche fiable de l’image de différents types de cellules dans le cerveau, y compris les microglies, les neurones et les cellules NG2⁺ comme exemples. Deux approches pour visualiser les cellules neuronales in vivo ont été développées : l’approche du crâne éclaircie et le crâne ouvert avec une approche crânienne de fenêtre. Bien que les approches minces de crâne soient en usage et sont préférées parce qu’elles surmontent certains des inconvénients de l’approche ouverte de crâne telle que l’activation de cellules gliales, la dynamique plus élevée-que-physiologique de la colonne vertébrale et l’utilisation des agents anti-inflammatoires^22,23,24,25, approches de crâne amincie montrent également quelques inconvénients critiques. Tout d’abord, la procédure d’amincissement est une procédure très délicate que de nombreux chercheurs trouvent difficile à perfectionner surtout lorsque le ré-amincissement est nécessaire. C’est le cas parce qu’il est souvent difficile pour les expérimentateurs de s’assurer qu’ils ont éclairci le crâne à une profondeur d’environ 20 μm. Deuxièmement, pour des comparaisons adéquates entre les souris, l’amincissement devrait être identique et une variété de succès d’amincissement entre les séances d’imagerie ou les souris pourrait compliquer la visualisation des structures neuronales. Troisièmement, lorsqu’ils sont utilisés pour l’imagerie longitudinale, les animaux avec des crânes amincis ne peuvent être utilisés que pour un nombre limité de séances lorsque le ré-amincissement du crâne est utilisé. Forth, puisque certains du tissu osseux reste encore, la clarté dans la profondeur de l’imagerie pourrait être compromise à partir de l’approche du crâne éclaircie permettant une grande visualisation de plus superficielle, mais pas autant avec des régions plus profondes. À la lumière de cela, des structures cérébrales plus profondes comme l’hippocampe, ne peuvent pas être correctement photographiés avec l’approche du crâne éclaircie. Ces considérations soulèvent la nécessité d’approches alternatives et complémentaires qui pourraient surmonter ces préoccupations.

Alternative à l’approche du crâne éclaircie, l’approche d’implantation de la fenêtre du crâne ouverte utilise une procédure dans laquelle le crâne est remplacé par un couvercle en verre optiquement clair. Cela permet un nombre quasi illimité de séances d’imagerie. En outre, étant donné le remplacement du crâne par le couvercle en verre, cette méthode permet une fenêtre de visualisation claire des cellules du cerveau marquées fluorescentement pendant de longues périodes de temps d’heures à des mois et, par conséquent, peut être utilisé pour étudier l’activité cellulaire et les interactions qui sont pertinentes pour la physiologie, le vieillissement et la pathologie.

Dans l’ensemble, nous détaillons les étapes qui peuvent être suivies pour implanter des fenêtres crâniennes chroniques à travers une craniotomie stéréotaxique qui permet l’imagerie in vivo des régions cérébrales d’intérêt. Nous décrivons également comment la vascularisation cérébrale grossièrement stable ou les dendrites fluorescentes étiquetées pourraient être utilisées pour générer une carte grossière ou fine, respectivement des régions d’intérêt du cerveau. Cette approche peut ensuite être utilisée pour l’imagerie répétée sur plusieurs séances. L’importance de cette technique réside donc dans sa capacité à imager les changements à long terme ou la stase dans les éléments du cerveau, y compris l’arrangement, la morphologie et les interactions des différents types cellulaires.