マウスにおける神経免疫ダイナミクスの反復インビボイメージングを行う正確な脳マッピング
Summary
このプロトコルは、神経-神経膠血管構造の縦画像化、相互作用、および健康および疾患条件の両方における機能に使用できる慢性頭蓋窓移植技術を記述する。これは、多くの場合、好ましいが、いくつかの重大な制限を有する経頭蓋イメージングアプローチに対する補完的な代替手段として機能する。
Abstract
中枢神経系(CNS)は、その適切な機能を促進する神経細胞、グリア、ストロマ、および血管細胞の複雑な相互作用によって調節される。これらの細胞を単離で研究するが、一緒にvitroまたは一緒にex vivoは有用な生理学的情報を提供する;神経細胞生理学の顕著な特徴は、そのような文脈で見逃される。そのため、生体内での神経細胞のネイティブでの研究が必要です。ここで詳述するプロトコルは、数時間から数ヶ月の間に長期間にわたって特定の細胞を視覚化し、研究するためのツールとして、げっ歯類皮質の神経細胞の反復的なin vivo 2光子イメージングについて説明しています。我々は、関心のある脳領域の細かい地図として粗い地図または蛍光標識デンドライトとして、ひどく安定した脳血管系の使用を詳細に説明する。これらのマップを視覚的な鍵として使用して、ニューラル細胞を正確に再配置して、その後の反復的なin vivoイメージングを行う方法を示す。このプロトコルは、蛍光標識ミクログリア、ニューロン、NG2+細胞のインビボイメージングの例+を用いて、この技術が長期間にわたって同じ脳の位置で細胞ダイナミクスを繰り返し可視化し、正常な生理学または病理学的侮辱に従ってこれらの細胞の構造的および機能的応答を理解するのにさらに役立つ能力を示す。必要に応じて、このアプローチは、例えばカルシウムイメージングと神経細胞の機能的イメージングに結合することができる。このアプローチは、特に、対象細胞にラベルを付ける遺伝的マウスモデルまたは特異的な色素が利用できる場合に、インビボでCNSの異なる細胞タイプ間の物理的相互作用を可視化する強力な技術です。
Introduction
中枢神経系(CNS)は、ニューロン、グリアおよび血管関連細胞を含む様々な常駐細胞タイプ間の相互作用の複雑な相互作用によって支配される。従来、神経細胞は,単離、共培養1、2、3、4、5(in2vitro)または切除された脳組織(ex,3,4,5 vivo)6、7、8、9、10の文脈で研究された。16,7,89,10しかし、インビボでのインビボのインタクトな脳のネイティブ環境における神経細胞の挙動および相互作用をさらに理解する必要がある。このプロトコルでは、インビボの対象領域をマッピングし、今後のイメージングセッションでそれらの領域を正確に再画像化し、さまざまなCNS細胞タイプ間の複雑な相互作用を長期間にわたって追跡する方法を説明する。
in vivoイメージングアプローチの開発は、神経機能,,11、12、13、14、15の適切な理解のために大きな利益を提供11,12,13してきました。14具体的には、これらのアプローチは、従来のin vitroおよびex vivoアプローチよりもいくつかの利点を提供します。まず、生体内イメージングシステムは、神経ネットワーク生理学の完全な理解を提供するために、細胞相互作用の完全なレパートリーを有する血管系などの生理学的に関連する細胞および組織成分を有する。第二に、最近の知見は、そのネイティブ環境から除去されると、特定の神経細胞(ミクログリアなど)が同一性の重要な特徴を失い、したがって、生体内設定で保存することができる生理学16、17を失うことを示唆している。16,第3に、in vivoイメージングシステムは、CNS細胞相互作用を研究するために数週間から数ヶ月の安定した縦方向の調査を行う機会を提供する。最後に、末梢免疫系18、19および19CNS生理学におけるマイクロバイオーム20、21からの寄与に関する証拠が増えているのを考えると、生体内システムはCNS細胞に対するそのような寄与および影響を尋問するプラットフォームを提供する。20,したがって、神経免疫生理学を研究するために生体内で縦方向のイメージングを採用するアプローチと、健康、負傷、および疾患状態における相互作用は、従来のアプローチに大きな補完的な追加です。
本プロトコルでは、ミクログリア、ニューロン、NG2+細胞を含む脳内の異なる細胞型を画像化+する信頼できるアプローチを例に挙げる。生体内の神経細胞を視覚化するための2つのアプローチが開発されました:間引かれた頭蓋骨のアプローチと頭蓋窓アプローチを持つ開いた頭蓋骨。薄くなった頭蓋骨のアプローチは使用中であり、グリア細胞活性化などの開いた頭蓋骨アプローチの欠点のいくつかを克服するために好まれるが、より高い生理学的脊柱ダイナミクスおよび抗炎症剤22、23、24、25の使用はまた、23,24いくつかの重要な欠点を示す。,25第一に、薄くする手順は、多くの研究者が特に再薄化が必要な場合に完璧にすることが困難であると感じる非常に繊細な手順です。これは、実験者が頭蓋骨を〜20μmの深さまで薄くしていることを確認することがしばしば困難であるためです。第二に、マウス間の適切な比較のためには、間伐が同一である必要があり、イメージングセッションまたはマウス間の様々な間の成功は、神経構造の視覚化を複雑にする可能性があります。第三に、縦断イメージングに用いられる場合、頭蓋骨を薄くした動物は、頭蓋骨の再薄化が採用される場合にのみ限られた数のセッションに使用することができる。第4に、骨組織の一部はまだ残っているので、イメージングの深さの明瞭さは、より表面的であるが、より深い領域ではそれほど表面的ではないの大きな視覚化を可能にする薄膜スカルアプローチから損なわれる可能性がある。これに照らして、海馬のようなより深い脳構造は、薄い頭蓋骨のアプローチでうまく画像化することはできません。これらの考慮事項は、これらの懸念を克服できる代替的かつ補完的なアプローチの必要性を高めます。
薄い頭蓋骨のアプローチに代えて、開いた頭蓋骨の窓の注入アプローチは、頭蓋骨が光学的に透明なガラスカバースリップに置き換えられる手順を使用する。これにより、ほぼ無制限の数のイメージングセッションが可能になります。さらに、頭蓋骨をガラスカバースリップに置き換えることを考えると、この方法は、数時間から数ヶ月の広範な時間にわたって蛍光タグ付き脳細胞の明確な表示ウィンドウを可能にし、したがって、生理学、老化および病理学に関連する細胞活性および相互作用を研究するために使用することができる。
全体として、我々は、関心のある脳領域の生体内イメージングを可能にする立体的頭蓋切開術を通じて慢性頭蓋窓を移植するために従うことができるステップを詳述する。また、ひどく安定した脳血管系または蛍光標識デンドライトを使用して、関心のある脳領域の粗い地図または細かい地図を生成する方法についても説明します。このアプローチは、複数のセッションで繰り返しイメージングするために使用できます。したがって、この技術の重要性は、異なる細胞型の配置、形態、相互作用を含む脳要素における長期的な変化またはスタシスを画像化する能力にある。
Protocol
Representative Results
Discussion
in vivo 2光子イメージングの出現は、健康な脳で起こる細胞相互作用とダイナミクスの多くを探求する機会を開きました。初期研究は、急性および慢性画像化37、38,38の両方による画像神経樹状突起への開いた頭蓋骨開頭切開法アプローチの使用に焦点を当てた。これはまた、脳内の神経免疫相互作用を解明するために使用することができます。.この…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この原稿で紹介するアイデアについて、Eyo研究室のメンバーに感謝します。私たちは、NG2DsRedマウス33の贈り物のためにバージニア大学のキプニスラボからジャスティン・ルステンホーフェン博士に感謝します.この研究は、国立衛生研究所の国立神経疾患・脳卒中研究所からU.B.E(K22 NS104392)への資金提供によって支えられている。
Materials
| Coverglass (3mm) | Warner Instruments | 64-0726 | |
| Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) | Amazon | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2 | |
| Demi Ultra LED Curing Light System | Dental Health Products, Inc | 910860-1 | |
| Dental Drill | Osada: www.osadausa.edu | EXL-M40 | |
| Drill Bit | Fine Science Tools | #19008-07 | |
| Eye Ointment | Henry Schien | 1338333 | |
| iBond Total Etch (Primer glue) | Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) | 66040094 | |
| Rhodamine B | Millipore Sigma | 81-88-9 (R6626) | |
| Tetris Evoflow glue (Final glue) | Top Dent (Ivoclar Vivadent) | #595956 | |
| Wahl Brav Mini+ | Amazon | https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1 |
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