Summary

Mappatura precisa del cervello per eseguire immagini ripetitive in vivo della dinamica neuroimmune nei topi

Published: August 07, 2020
doi:

Summary

Questo protocollo descrive una tecnica cronica di impianto della finestra cranica che può essere utilizzata per l’imaging longitudinale di strutture neuro-glio-vascolari, interazioni e funzione sia in condizioni sane che malate. Serve come alternativa complementare all’approccio di imaging transcranico che, sebbene spesso preferito, possiede alcune limitazioni critiche.

Abstract

Il sistema nervoso centrale (CNS) è regolato da un complesso gioco di cellule neuronali, gliali, stromali e vascolari che facilitano la sua corretta funzione. Anche se studiare queste cellule in isolamento in vitro o insieme ex vivo fornisce informazioni fisiologiche utili; caratteristiche salienti della fisiologia delle cellule neurali mancheranno in tali contesti. Pertanto, c’è la necessità di studiare le cellule neurali nel loro ambiente nativo in vivo. Il protocollo qui descritto descrive l’imaging ripetitivo in vivo a due fotoni delle cellule neurali nella corteccia del roditore come strumento per visualizzare e studiare celle specifiche per lunghi periodi di tempo da ore a mesi. Descriviamo in dettaglio l’uso della vascolatura cerebrale grossolanamente stabile come una mappa grossolana o dendrites fluorescente come una mappa fine di alcune regioni cerebrali di interesse. Usando queste mappe come chiave visiva, mostriamo come le cellule neurali possono essere riposizionate con precisione per la successiva imaging in vivo ripetitivo. Utilizzando esempi di immagini in vivo di microglia fluorescente, neuroni ecellule NG2, questo protocollo dimostra la capacità di questa tecnica di consentire la visualizzazione ripetitiva delle dinamiche cellulari nella stessa posizione del cervello per lunghi periodi di tempo, che possono aiutare ulteriormente a comprendere le risposte strutturali e funzionali di queste cellule nella fisiologia normale o a seguire insulti patologici. Ove necessario, questo approccio può essere accoppiato all’imaging funzionale delle cellule neurali, ad esempio con l’imaging del calcio. Questo approccio è particolarmente una tecnica potente per visualizzare l’interazione fisica tra diversi tipi di cellule del CNS in vivo quando sono disponibili modelli di topo genetici o coloranti specifici con tag fluorescenti distinti per etichettare le cellule di interesse.

Introduction

Il sistema nervoso centrale (CNS) è governato da una complessa interazione di interazioni tra vari tipi di cellule residenti, tra cui neuroni, glia e cellule associate ai vasi. Tradizionalmente, le cellule neurali sono state studiate in contesti isolati, co-coltura1,2,3,4,5 (in vitro) o ascisi (ex vivo)6,7,8,9,10. Tuttavia, c’è bisogno di comprendere ulteriormente il comportamento delle cellule neurali e le interazioni nell’ambiente nativo del cervello intatto in vivo. In questo protocollo, descriviamo un metodo per mappare le regioni in vivo di interesse e ri-immaginare con precisione quelle regioni in future sessioni di imaging per tenere traccia delle complesse interazioni tra i vari tipi di cellule CNS per lunghi periodi di tempo.

Lo sviluppo di approcci di imaging in vivo ha fornito significativi vantaggi per la corretta comprensione della funzione neurale11,12,13,14,15. In particolare, questi approcci offrono diversi vantaggi rispetto agli approcci tradizionali in vitro ed ex vivo. In primo luogo, i sistemi di imaging in vivo hanno componenti cellulari e tissutali fisiologicamente rilevanti come la vascolatura con il repertorio completo delle interazioni cellulari per fornire una comprensione completa della fisiologia della rete neurale. In secondo luogo, recenti scoperte suggeriscono che quando vengono rimosse dal loro ambiente nativo, alcune cellule neurali (come la microglia) perdono caratteristiche importanti della loro identità e quindi della fisiologia16,17 che possono essere conservate nell’ambiente in vivo. In terzo luogo, i sistemi di imaging in vivo offrono l’opportunità di indagini longitudinali stabili da settimane a mesi per studiare le interazioni cellulari del SNC. Infine, date le crescenti prove dei contributi del sistema immunitario periferico18,19 e del microbioma20,21 nella fisiologia del CNS, i sistemi in vivo forniscono una piattaforma per interrogare tali contributi ed effetti sulle cellule del SNC. Pertanto, gli approcci che utilizzano l’imaging in vivo longitudinale per studiare la fisiologia neuro-immune e le interazioni in stati sani, feriti e malati sono una grande aggiunta complementare agli approcci tradizionali.

In questo protocollo, descriviamo un approccio affidabile all’immagine di diversi tipi di cellule nel cervello, tra cui microglia, neuroni e cellule NG2 come esempi. Sono stati sviluppati due approcci per visualizzare le cellule neurali in vivo: l’approccio del cranio assottigliato e il cranio aperto con un approccio cranico alla finestra. Anche se gli approcci al cranio assottigliati sono in uso e sono preferiti perché superano alcuni degli svantaggi dell’approccio al cranio aperto come l’attivazione delle cellule gliali, la dinamica della colonna vertebrale superiore a quella fisiologica e l’uso di agenti antinfiammatori22,23,24,25, approcci cranio assottigliati mostrano anche alcuni inconvenienti critici. In primo luogo, la procedura di assottigliamento è una procedura molto delicata che molti ricercatori trovano difficile da perfezionare soprattutto quando è necessario re-diradning. Questo è il caso perché è spesso difficile per gli sperimentatori accertare di aver assottigliato il cranio a una profondità di 20 m. In secondo luogo, per un confronto adeguato tra i topi, l’assottigliamento dovrebbe essere identico e una varietà di successo di assottigliamento tra sessioni di imaging o topi potrebbe complicare la visualizzazione delle strutture neurali. In terzo luogo, se impiegati per l’imaging longitudinale, gli animali con teschi assottigliati possono essere utilizzati solo per un numero limitato di sessioni quando viene impiegato il re-sottile del cranio. Forth, poiché parte del tessuto osseo rimane ancora, la chiarezza di imaging potrebbe essere compromessa dall’approccio del cranio assottigliato, consentendo una grande visualizzazione di regioni più superficiali ma non tanto con le regioni più profonde. Alla luce di questo, strutture cerebrali più profonde come l’ippocampo, non possono essere imagete con successo con l’approccio del cranio assottigliato. Queste considerazioni sollevano la necessità di approcci alternativi e complementari che potrebbero superare tali preoccupazioni.

Alternativa all’approccio del cranio assottigliato, l’approccio all’impianto della finestra del cranio aperto utilizza una procedura in cui il cranio viene sostituito con un coperchio di vetro otticamente chiaro. Ciò consente un numero quasi illimitato di sessioni di imaging. Inoltre, data la sostituzione del cranio con la vetrina di vetro, questo metodo consente una chiara finestra di visualizzazione delle cellule cerebrali marcate fluorescenti per lunghi periodi da ore a mesi e, quindi, può essere impiegato per studiare l’attività cellulare e le interazioni che sono rilevanti per la fisiologia, l’invecchiamento e la patologia.

Nel complesso, dettagliamo i passi che possono essere seguiti per fare finestre craniche croniche implantare attraverso una craniotomia stereotassica che consente l’imaging in vivo delle regioni cerebrali di interesse. Descriviamo anche come la vascolatura cerebrale grossolanamente stabile o i dendriti fluorescenti potrebbero essere utilizzati per generare una mappa grossolana o fine, rispettivamente delle regioni cerebrali di interesse. Questo approccio può quindi essere utilizzato per l’imaging ripetuto in più sessioni. L’importanza di questa tecnica, quindi, sta nella sua capacità di immaginare i cambiamenti a lungo termine o la stasi negli elementi cerebrali, tra cui la disposizione, la morfologia e le interazioni dei diversi tipi cellulari.

Protocol

Tutte le fasi sono conformi alle linee guida stabilite e approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali della Virginia. 1. Preparazione del mouse per l’impianto della finestra cranica NOTA: Varie linee di topo transgeniche con etichette florescenti sono adatte per l’imaging. Utilizzare i topi CX3CR1GFP/o 26 per visualizzare la microglia in vivo. Tipicamente, vengono utilizzati topi da giovani a gio…

Representative Results

Per visualizzare le dinamiche microgliali in vivo, sono stati utilizzati doppi topi transgenici CX3CR1GFP/-a:Thy1YFP. La linea Thy1-YFP H viene utilizzata in contrapposizione alla linea Thy1-GFP M per evitare la sovrapposizione di florescenza di microglia (GFP) e neuroni (YFP). Gli approcci alternativi potrebbero utilizzare una linea reporter in cui la microglia è etichettata con ad esempio tdTomato e quindi la linea Thy1-GFP M. Uno svantaggio della linea H è che YFP etichetta un sacco di neuroni …

Discussion

L’avvento dell’imaging a due fotoni in vivo ha aperto l’opportunità di esplorare la pletora di interazioni cellulari e dinamiche che si verificano nel cervello sano. Initial studies focused on using the open skull craniotomy approach to image neuronal dendrites by both acute and chronic imaging37,38. Questo può essere utilizzato anche per chiarire le interazioni neuroimmuni nel cervello. Questo protocollo descrive un metodo per l’imaging affidabile delle cellul…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo i membri del laboratorio Eyo per aver discusso le idee presentate in questo manoscritto. Ringraziamo il Dr. Justin Rustenhoven del Kipnis Lab dell’Università della Virginia per il dono di topi NG2DsRed 33. Questo lavoro è supportato da finanziamenti del National Institute of Neurological Disorders and Stroke del National Institute of Health a U.B.E (K22 NS104392).

Materials

Coverglass (3mm) Warner Instruments 64-0726
Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) Amazon https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2
Demi Ultra LED Curing Light System Dental Health Products, Inc 910860-1
Dental Drill Osada: www.osadausa.edu EXL-M40
Drill Bit Fine Science Tools #19008-07
Eye Ointment Henry Schien 1338333
iBond Total Etch (Primer glue) Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) 66040094
Rhodamine B Millipore Sigma 81-88-9 (R6626)
Tetris Evoflow glue (Final glue) Top Dent (Ivoclar Vivadent) #595956
Wahl Brav Mini+ Amazon https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1

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Cite This Article
Bisht, K., Sharma, K., Eyo, U. B. Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice. J. Vis. Exp. (162), e61454, doi:10.3791/61454 (2020).

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