Mappatura precisa del cervello per eseguire immagini ripetitive in vivo della dinamica neuroimmune nei topi

Il sistema nervoso centrale (CNS) è governato da una complessa interazione di interazioni tra vari tipi di cellule residenti, tra cui neuroni, glia e cellule associate ai vasi. Tradizionalmente, le cellule neurali sono state studiate in contesti isolati, co-coltura^1,2,3,4,5 (in vitro) o ascisi (ex vivo)^6,7,8,9,10. Tuttavia, c’è bisogno di comprendere ulteriormente il comportamento delle cellule neurali e le interazioni nell’ambiente nativo del cervello intatto in vivo. In questo protocollo, descriviamo un metodo per mappare le regioni in vivo di interesse e ri-immaginare con precisione quelle regioni in future sessioni di imaging per tenere traccia delle complesse interazioni tra i vari tipi di cellule CNS per lunghi periodi di tempo.

Lo sviluppo di approcci di imaging in vivo ha fornito significativi vantaggi per la corretta comprensione della funzione neurale^{11,12,13,14,15}. In particolare, questi approcci offrono diversi vantaggi rispetto agli approcci tradizionali in vitro ed ex vivo. In primo luogo, i sistemi di imaging in vivo hanno componenti cellulari e tissutali fisiologicamente rilevanti come la vascolatura con il repertorio completo delle interazioni cellulari per fornire una comprensione completa della fisiologia della rete neurale. In secondo luogo, recenti scoperte suggeriscono che quando vengono rimosse dal loro ambiente nativo, alcune cellule neurali (come la microglia) perdono caratteristiche importanti della loro identità e quindi della fisiologia^16,17 che possono essere conservate nell’ambiente in vivo. In terzo luogo, i sistemi di imaging in vivo offrono l’opportunità di indagini longitudinali stabili da settimane a mesi per studiare le interazioni cellulari del SNC. Infine, date le crescenti prove dei contributi del sistema immunitario periferico^18,19 e del microbioma^20,21 nella fisiologia del CNS, i sistemi in vivo forniscono una piattaforma per interrogare tali contributi ed effetti sulle cellule del SNC. Pertanto, gli approcci che utilizzano l’imaging in vivo longitudinale per studiare la fisiologia neuro-immune e le interazioni in stati sani, feriti e malati sono una grande aggiunta complementare agli approcci tradizionali.

In questo protocollo, descriviamo un approccio affidabile all’immagine di diversi tipi di cellule nel cervello, tra cui microglia, neuroni e cellule NG2^– come esempi. Sono stati sviluppati due approcci per visualizzare le cellule neurali in vivo: l’approccio del cranio assottigliato e il cranio aperto con un approccio cranico alla finestra. Anche se gli approcci al cranio assottigliati sono in uso e sono preferiti perché superano alcuni degli svantaggi dell’approccio al cranio aperto come l’attivazione delle cellule gliali, la dinamica della colonna vertebrale superiore a quella fisiologica e l’uso di agenti antinfiammatori^22,23,24,25, approcci cranio assottigliati mostrano anche alcuni inconvenienti critici. In primo luogo, la procedura di assottigliamento è una procedura molto delicata che molti ricercatori trovano difficile da perfezionare soprattutto quando è necessario re-diradning. Questo è il caso perché è spesso difficile per gli sperimentatori accertare di aver assottigliato il cranio a una profondità di 20 m. In secondo luogo, per un confronto adeguato tra i topi, l’assottigliamento dovrebbe essere identico e una varietà di successo di assottigliamento tra sessioni di imaging o topi potrebbe complicare la visualizzazione delle strutture neurali. In terzo luogo, se impiegati per l’imaging longitudinale, gli animali con teschi assottigliati possono essere utilizzati solo per un numero limitato di sessioni quando viene impiegato il re-sottile del cranio. Forth, poiché parte del tessuto osseo rimane ancora, la chiarezza di imaging potrebbe essere compromessa dall’approccio del cranio assottigliato, consentendo una grande visualizzazione di regioni più superficiali ma non tanto con le regioni più profonde. Alla luce di questo, strutture cerebrali più profonde come l’ippocampo, non possono essere imagete con successo con l’approccio del cranio assottigliato. Queste considerazioni sollevano la necessità di approcci alternativi e complementari che potrebbero superare tali preoccupazioni.

Alternativa all’approccio del cranio assottigliato, l’approccio all’impianto della finestra del cranio aperto utilizza una procedura in cui il cranio viene sostituito con un coperchio di vetro otticamente chiaro. Ciò consente un numero quasi illimitato di sessioni di imaging. Inoltre, data la sostituzione del cranio con la vetrina di vetro, questo metodo consente una chiara finestra di visualizzazione delle cellule cerebrali marcate fluorescenti per lunghi periodi da ore a mesi e, quindi, può essere impiegato per studiare l’attività cellulare e le interazioni che sono rilevanti per la fisiologia, l’invecchiamento e la patologia.

Nel complesso, dettagliamo i passi che possono essere seguiti per fare finestre craniche croniche implantare attraverso una craniotomia stereotassica che consente l’imaging in vivo delle regioni cerebrali di interesse. Descriviamo anche come la vascolatura cerebrale grossolanamente stabile o i dendriti fluorescenti potrebbero essere utilizzati per generare una mappa grossolana o fine, rispettivamente delle regioni cerebrali di interesse. Questo approccio può quindi essere utilizzato per l’imaging ripetuto in più sessioni. L’importanza di questa tecnica, quindi, sta nella sua capacità di immaginare i cambiamenti a lungo termine o la stasi negli elementi cerebrali, tra cui la disposizione, la morfologia e le interazioni dei diversi tipi cellulari.