رسم خرائط دقيقة للدماغ لأداء المتكررة في التصوير فيفو من ديناميات العصبية المناعية في الفئران

ويحكم الجهاز العصبي المركزي (CNS) من قبل تفاعل معقد من التفاعلات بين أنواع الخلايا المقيمة المختلفة بما في ذلك الخلايا العصبية، جاليا والخلايا المرتبطة بالأوعية. تقليديا، درست الخلايا العصبية في معزولة، شارك في استزراع^{1،,2،,3،,4،,5} (في المختبر) أو أنسجة الدماغ المخ المخ (السابق vivo)^{6،7،,8،,9،,10} سياقات.^, ومع ذلك، هناك حاجة إلى فهم مزيد من سلوك الخلية العصبية والتفاعلات في البيئة الأصلية للدماغ سليمة في الجسم الحي. في هذا البروتوكول، نحن وصف طريقة لرسم خريطة في المناطق vivo من الفائدة وإعادة بالضبط صورة تلك المناطق في المستقبل جلسات التصوير لتتبع التفاعلات المعقدة بين مختلف أنواع الخلايا CNS على مدى فترات طويلة من الزمن.

وقد وفرت تطوير في الأساليب التصوير في الجسم الحي مكاسب كبيرة للفهم السليم من وظيفة العصبية^{11،12،13،14،15}. وتوفر هذه الأساليب على وجه التحديد مزايا عديدة على النهج التقليدية في المختبر وفي المختبر. أولاً، في أنظمة التصوير الحي لديها الخلايا ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ومكونات الأنسجة مثل الأوعية الدموية مع ذخيرة كاملة من التفاعلات الخلوية لتوفير فهم كامل للفسيولوجيا الشبكة العصبية. ثانيا، تشير النتائج الأخيرة إلى أنه عند إزالتها من بيئتها الأصلية، تفقد بعض الخلايا العصبية (مثل ميكروجليا) ميزات هامة من هويتها، وبالتالي علم وظائف الأعضاء^16،17 والتي يمكن الحفاظ عليها في وضع في الجسم الحي. ثالثاً، توفر أنظمة التصوير الحي الفرصة لإجراء تحقيقات طولية مستقرة من أسابيع إلى أشهر لدراسة التفاعلات الخلوية التي يقوم بها الجهاز العصبي المركزي. وأخيرا، ونظرا للأدلة المتزايدة للمساهمات من الجهاز المناعي الطرفي^18،,19 والميكروبيوم^20،21 في علم وظائف الأعضاء في الجهاز العصبي المركزي، في نظم الجسم الحي توفير منصة لاستجواب هذه المساهمات والآثار على خلايا الجهاز العصبي المركزي. وهكذا، فإن النهج التي تستخدم الطولية في التصوير الجسمي لدراسة فسيولوجيا المناعة العصبية والتفاعلات في الدول الصحية والمصابة والمرضى هي إضافة تكميلية كبيرة إلى النهج التقليدية.

في هذا البروتوكول، ونحن وصف نهج موثوق به لصورة أنواع الخلايا المختلفة في الدماغ بما في ذلك microglia، والخلايا العصبية والخلايا^{NG2 +} كأمثلة. وقد تم تطوير نهجين لتصور الخلايا العصبية في الجسم الحي: نهج الجمجمة رقيقة والجمجمة المفتوحة مع نهج نافذة الجمجمة. على الرغم من أن الأساليب رقيقة الجمجمة هي قيد الاستخدام ويفضل لأنها التغلب على بعض مساوئ نهج الجمجمة المفتوحة مثل تنشيط الخلايا الدبقية, أعلى من الفسيولوجية ديناميات العمود الفقري واستخدام العوامل المضادة للالتهابات^22,23,24,25, كما تظهر ضعف الجمجمة النهج بعض العيوب الحرجة. أولاً، الإجراء ترقق هو إجراء دقيق جداً أن العديد من الباحثين يجدون صعوبة في الكمال خاصة عندما إعادة ترقق ضروري. هذا هو الحال لأنه غالبا ما يكون من الصعب على المجربين التأكد من أن لديهم رقيقة الجمجمة إلى عمق 20 μm~ . ثانياً، بالنسبة للمقارنات الكافية بين الفئران، فإن الترقق يجب أن يكون متطابقًا ويمكن لمجموعة متنوعة من النجاح في الترقق بين جلسات التصوير أو الفئران أن تعقد التصور للهياكل العصبية. ثالثاً، عندما تستخدم في التصوير الطولي، لا يمكن استخدام الحيوانات ذات الجماجم الرقيقة إلا لعدد محدود من الجلسات عند استخدام إعادة ترقق الجمجمة. جيئة وذهابا ، لأن بعض الأنسجة العظمية لا تزال قائمة ، يمكن أن يكون للخطر وضوح في عمق التصوير من نهج الجمجمة رقيقة مما يسمح لتصور كبير من أكثر سطحية ولكن ليس بقدر مع مناطق أعمق. في ضوء هذا، هياكل الدماغ أعمق مثل قرن آمون، لا يمكن أن تكون صورة بنجاح مع نهج الجمجمة رقيقة. وتثير هذه الاعتبارات الحاجة إلى نهج بديلة ومتكاملة يمكن أن تتغلب على هذه الشواغل.

بديل لنهج الجمجمة رقيقة، نهج زرع نافذة الجمجمة المفتوحة يستخدم إجراء الذي يتم استبدال الجمجمة مع غطاء زجاجي واضح بصريا. وهذا يسمح لعدد غير محدود تقريبا من جلسات التصوير. وعلاوة على ذلك ، نظرا لاستبدال الجمجمة مع غطاء الزجاج ، وهذا الأسلوب يسمح لنافذة عرض واضحة من خلايا الدماغ الموسومة الفلورسنت لفترات طويلة من المرات من ساعات إلى أشهر ، وبالتالي ، يمكن استخدامها لدراسة نشاط الخلية والتفاعلات التي هي ذات الصلة لعلم وظائف الأعضاء والشيخوخة وعلم الأمراض.

عموما، نحن تفاصيل الخطوات التي يمكن اتباعها للقيام زرع النوافذ القحفية المزمنة من خلال استئصال القحف ستيريو التي تمكن في التصوير الجسم الحي للمناطق الدماغ من الفائدة. كما نصف كيف يمكن استخدام الأوعية الدموية المستقرة بشكل صارخ أو التشعبات الفلورية المسماة لتوليد خريطة خشنة أو دقيقة ، على التوالي من مناطق الدماغ ذات الاهتمام. ويمكن بعد ذلك استخدام هذا الأسلوب للتصوير المتكرر على مدى عدة جلسات. وتكمن أهمية هذه التقنية في قدرتها على تصوير التغيرات الطويلة الأجل أو الركود في عناصر الدماغ بما في ذلك الترتيب، والمورفولوجيا، والتفاعلات بين الأنواع الخلوية المختلفة.