Embryo-Mikroinjektionstechniken für eine effiziente ortsspezifische Mutagenese bei Culex quinquefasciatus
Summary
Dieses Protokoll beschreibt Mikroinjektionsverfahren für Culex quinquefasciatus-Embryonen, die für die Arbeit mit CRISPR/Cas9-Genbearbeitungswerkzeugen optimiert sind. Diese Technik kann effizient ortsspezifische, vererbbare Keimbahnmutationen erzeugen, die für den Aufbau genetischer Technologien in diesem wenig untersuchten Krankheitsvektor verwendet werden können.
Abstract
Culex quinquefasciatus ist ein Vektor einer Vielzahl von vektorübertragenen Krankheiten wie Vogelmalaria, West-Nil-Virus (WNV), Japanische Enzephalitis, östliche Pferdeenzephalitis, lymphatische Filariose und Saint Louis-Enzephalitis. Insbesondere vogelmalaria hat eine wichtige Rolle beim Aussterben zahlreicher endemischer Inselvogelarten gespielt, während WNV in den Vereinigten Staaten zu einer wichtigen vektorübertragenen Krankheit geworden ist. Um weitere Einblicke in die Biologie von C. quinquefasciatus zu erhalten und ihre genetische Kontroll-Toolbox zu erweitern, müssen wir effizientere und erschwinglichere Methoden für das Genome Engineering bei dieser Art entwickeln. Einige biologische Merkmale, die für Culex-Moskitos einzigartig sind, insbesondere ihre Eierflöße, haben es jedoch schwierig gemacht, Mikroinjektionsverfahren durchzuführen, die für das Genom-Engineering erforderlich sind. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir ein optimiertes Mikroinjektionsprotokoll für Embryonen entwickelt, das sich auf die Minderung der technischen Hindernisse konzentriert, die mit den einzigartigen Eigenschaften von Culex-Moskitos verbunden sind. Diese Verfahren zeigen optimierte Methoden für die Eizellentnahme, die Trennung von Eierfloßen und andere Handhabungsverfahren, die für eine erfolgreiche Mikroinjektion bei C. quinquefasciatus unerlässlich sind. In Verbindung mit der CRISPR/Cas9-Genom-Editing-Technologie ermöglichen uns diese Verfahren, ortsspezifische, effiziente und vererbbare Keimbahnmutationen zu erreichen, die erforderlich sind, um fortschrittliches Genom-Engineering durchzuführen und genetische Kontrolltechnologien in diesem wichtigen, aber derzeit noch nicht untersuchten Krankheitsvektor zu entwickeln.
Introduction
C. quinquefasciatus, allgemein bekannt als die südliche Hausmücke, ist ein kompetenter Vektor zahlreicher Krankheitserreger, darunter West-Nil-Virus (WNV), Japanische Enzephalitis, Saint Louis-Enzephalitis und Östliche Pferdeenzephalitis. Insbesondere seit seiner ersten Erkennung in New York im Jahr 1999 hat sich WNV zu einer der wichtigsten vektorübertragenen Krankheiten in den kontinentalen Vereinigten Staaten (USA) entwickelt, mit über 50.000 gemeldeten menschlichen Fällen, die zwischen 1999 und 2018 zu rund 2.300 Todesfällenführten 1 sowie über 4.500 gemeldeten Pferdefällen zwischen 2008 und 20192. Darüber hinaus sind mindestens 23 in Nordamerika vorkommende Vogelarten von WNV-Infektionen betroffen, wobei mindestens 12 Arten aufgrund von WNV3als unwiederbringlich eingestuft wurden. Die Auswirkungen von WNV auf Menschliche, Pferde- und Vogelpopulationen sind auf das opportunistische Fressverhalten seiner Vektoren zurückzuführen. Typischerweise sind Vögel die primären Wirte für WNV, und Menschen und Pferde sind zufällige oder Sackgassenwirte. Einige von C. quinquefasciatus vektorisierten Krankheitserreger infizieren nur Vögel wie den Vogelmalariaparasiten Plasmodium relictum. In Hawaii ist C. quinquefasciatus ein Hauptvektor der Vogelmalaria und hat das Aussterben vieler einheimischer Vogelarten verursacht4,5.
Um Krankheiten zu kontrollieren, die von C. quinquefasciatusübertragen werden, haben Forscher und Vektorkontrollbehörden häufig etablierte Instrumente zur Kontrolle der Mückenpopulation wie die Anwendung von Insektiziden6verwendet, diese Methoden sind jedoch kostspielig, nicht artspezifisch und haben eine begrenzte Wirksamkeit, da die Resistenz gegen Insektizide in vielen C. quinquefasciatus-Populationen hoch ist6,7,8,9. Andere Kontrolltechniken, wie Wolbachia-basiertePopulationskontrollstrategien, wurden in den letzten Jahrenentwickelt 10,11, aber die mit wolbachia-Infektion verbundenen Fitnesskosten begrenzen die Machbarkeit dieses Ansatzes für diesen Vektor12. Es gibt auch genetisch basierte Bekämpfungsmethoden, die bei anderen Mückenarten wie Aedes aegypti13 , 14, Anopheles gambiae15 und Anopheles stephensi16 entwickelt wurden , einschließlich der Entwicklung von pathogenresistenten Moskitos17,18,19, die auch für C. quinquefasciatus entwickelt werden könnten, wenn die erforderlichen Genom-Engineering-Werkzeuge entwickelt für diese Art. Die Biologie von C. quinquefasciatus unterscheidet sich jedoch stark von anderen Aedes- und Anopheles-Mückenvektoren, was die Entwicklung ähnlicher genetischer Technologien in diesem Vektor erschwert hat. Mit dem Aufkommen von CRISPR-basierten Genom-Engineering-Technologien ist präzises Genome Engineering immer trivialer, erschwinglicher und anpassungsfähiger geworden und hat folglich zur Entwicklung neuartiger genetischer Werkzeuge in einer Vielzahl von Arten geführt.
Um Mutationen mit CRISPR-basierten Technologien zu erzeugen, wird eine Mischung aus Cas9-Protein und synthetischer Leit-RNA (sgRNA), die die gewünschten Loci ergänzt, in Embryonen im Präblastodermstadium mikroinjektiert. Da C. quinquefasciatus Weibchen ihre Eier in Gruppen ablegen, die in einer schwimmenden Floßstruktur befestigt sind (Abbildung 1), im Gegensatz zum Ovipositieren einzelner Eier, einem Merkmal von Aedes und Anopheles Moskitos, werden Embryo-Mikroinjektionen bei dieser Art zunehmend komplizierter. Culex-Larven treten auch von der vorderen Seite jedes Eies auf, die mit der Wasseroberfläche in Kontakt kommt (Abbildung 1), so dass die Eiorientierung nach der Manipulation bei dieser Art wichtig ist. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Mikroinjektion von Cas9-Protein und sgRNA in C. quinquefasciatus-Embryonen. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Merkmale zu berücksichtigen, die für die Culex-Biologie einzigartig sind, um das Überleben von Embryonen und die Genommutationsraten durch bestimmte Schritte zu verbessern, die für die rechtzeitige Eizellentnahme und das Überleben von Eizellen entscheidend sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit den jüngsten Bemühungen, gentechnisch veränderte Werkzeuge für die Kontrolle von Mückenvektoren zu entwickeln, besteht die Notwendigkeit, Embryo-Mikroinjektionsprotokolle für häufige Mückenkrankheitsvektoren zu entwickeln und zu optimieren. Obwohl Methoden für Aedes- und Anopheles-Moskitos entwickelt wurden, wurde ein speziell für Culex entwickeltes Protokoll minimal erforscht. Im Allgemeinen können die Injektionsprotokolle für Moskito-Embryonen in 3 allgemeine Schritte unterteilt werden: 1) Embryo-Entnahme und -Vorbereitung, 2) Embryo-Injektion und 3) Wiederherstellung nach der Injektion. Um erfolgreich Mutanten zu erzeugen, müssen alle drei Schritte für die Zielspezies optimiert werden. Dieses modifizierte Protokoll für die Mikroinjektion von Embryonen ist spezifisch für das erfolgreiche Genom-Engineering von Culex-Moskitos.
Die Maximierung der Embryonentnahme ist ein häufiger Engpass bei Mikroinjektionsprotokollen für Embryonen. Um die Anzahl der in kurzer Zeit gesammelten Eier zu erhöhen, wurden Moskitos für 2-3 Tage nach der Blutmahlzeit von einem Eiablagesubstrat eingeschränkt. Es ist wichtig zu beachten, dass C. quinquefasciatus dazu neigt, Vogelblutquellen im Gegensatz zu Säugetierquellen oder Membranfütterung mit Säugetierblut zu bevorzugen. Viele Forscher haben jedoch Schwierigkeiten, eine zuverlässige Quelle für lebende Vögel oder Vogelblut für die Blutfütterung zu erhalten, so dass Laborbestände angepasst werden können, um sich von leichter zugänglichen Blutquellen zu ernähren. Es ist auch wichtig, nährstoffreiches Wasser für das Eiablagesubstrat zu verwenden, da es Eiablagehinweise für C. quinquefasciatus und die meisten anderen Culex-Vektoren liefert. Es gibt viele Methoden, um nährstoffreiches Wasser zu erzeugen, das möglicherweise zwischen den Laboren optimiert werden muss, um sicherzustellen, dass eine angemessene Anzahl von Eiern für die Mikroinjektion zur Verfügung steht. Während diese Methode beispielsweise bei Kaninchenkot, der 5 oder mehr Tage lang in entionisiertem Wasser fermentiert wurde, am erfolgreichsten war, haben andere Forscher mehr Erfolg mit Gras- oder Fischfutter als Nährstoffquelle und einige sogar mit destilliertem Wasser21.
Da Culex-Moskitos Gruppen von Eiern in Flößen legen, ist das Sammeln von Eiern ziemlich einfach. Eier können einfach gesammelt werden, indem das gesamte Floß mit einem Pinsel geschöpft wird. Die Trennung der Eier ist komplizierter, aber für eine erfolgreiche Injektion unerlässlich. Eier können vorsichtig vom Floß getrennt werden, indem mit Pinsel oder Sparzette sanfter Abwärtsdruck zwischen den Eiern ausgeübt wird. Mit etwas Übung waren mehrere Benutzer zuverlässig in der Lage, einzelne Eier von Eierflößen zu trennen. Nach dem Trennen jedes Eies werden die Eier in der gleichen Ausrichtung auf doppelseitigem Klebeband ausgerichtet, das die Eier während der Mikroinjektion stabilisiert. Eier werden in das sich verjüngende hintere Ende injiziert und die Zugabe von Halogenkohlenstofföl hält die Eier während der Manipulation feucht.
Um Embryoschäden während der Mikroinjektion zu begrenzen, müssen Injektionsnadeln von angemessener Stärke sein und in einem geeigneten Winkel abgeschrägt sein. Aluminosilikatnadeln, die 10 Sekunden lang in einem Winkel von 50 ° abgeschrächt wurden, hatten die besten Ergebnisse, aber auch Borosilikat- und Quarznadeln können funktionieren, obwohl sie weniger haltbar und teurer sein können. Darüber hinaus erleichtert die richtige Nadelfass einen besseren Fluss der Cas9- und sgRNA-Mischungen und schafft einen schärferen Punkt für ein leichteres Eindringen in den Embryo. In vielen Fällen ist das Abfasen auch eine effiziente Möglichkeit, verstopfte Nadeln schnell zu reparieren, anstatt Zeit und Mühe damit zu verbringen, verstopfte Nadeln zu ersetzen.
Nach der Injektion sollten die Eier mindestens 5 Minuten ungestört bleiben, wobei das Halogenkohlenstofföl unmittelbar danach durch sanftes Abbürsten mit einem sauberen Pinsel entfernt werden sollte. Nach dem Entfernen des Halogenkohlenwasserstofföls können die injizierten Eier zum Schlüpfen in Wasser gelegt werden, was typischerweise innerhalb von 3 Tagen nach der Injektion geschieht. Mit Übung und ausreichender Anzahl von Eiern kann dieses Protokoll konsistente somatische und Keimbahnmutationen bei C. quinquefasciatus erreichen und ist vielseitig genug, dass es leicht an andere Culex-Moskitos angepasst werden kann.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch UCSD-Startup-Fonds unterstützt, die an O.S.A. gerichtet waren.
Materials
| 9 oz clear plastic pet cup | Karat | C-KC9 | Insect Rearing and Egg Collection |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate |
| Blood | Colorado Serum Company | 31025 | The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection. |
| Bugdorm | Bugdorm | 4F2222 | Insect Rearing Cage |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | Microinjection |
| Compound Microscope | Olympus BX41 | Microinjection, for embryo injection | |
| Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | Microinjection, to be used with beveler |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Microinjection |
| Double-sided Tape | Scotch | B084NVQGXD | Microinjection, embryo alignment |
| Femtojet 4x or 4i programmable microinjector | Eppendorf | Microinjection | |
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | Microinjection |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Microinjection, embryo collection |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | Microinjection, embryo alignment |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773 | Microinjection, embryo alignment |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | Microinjection, embryo alignment |
| Hemotek | Hemotek | PS5 | Line Maintenance |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | Microinjection, needle beveling |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | Microinjection, needle pulling |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | Microinjection, embryo alignment |
| Non-Drying Modeling Clay | Jovi | B0025Z71IM | Microinjection, needle storage |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | Microinjection, for embryo alignment |
| Sugar | Domino | 20% sugar solution for adult sugar source. | |
| T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Preparation of microinjection materials |
| TOPO TA Cloning Kit | ThermoFischer Scientific | K451020 | Preparation of microinjection materials |
| Ultra-fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | Microinjection, embryo alignment |
References
- Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC Available from: https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight (2019)
- APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA Available from: https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv (2020)
- Luke George, T., et al. Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).
- van Riper, C., van Riper, S. G., Lee Goff, M., Laird, M. The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds. Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).
- Liao, W., Atkinson, C. T., LaPointe, D. A., Samuel, M. D. Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change. PloS One. 12 (1), 0168880 (2017).
- Martins, W. F. S., et al. Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 9 (1), 11406 (2019).
- Norris, L. C., Norris, D. E. Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia. Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).
- Corbel, V., et al. Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa. Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).
- Yadouléton, A., et al. Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin. Parasites & Vectors. 8, 17 (2015).
- Atyame, C. M., et al. Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions. PloS One. 10 (3), 0119288 (2015).
- Atyame, C. M., et al. Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440 (2011).
- Almeida, F., et al. Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae). Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).
- Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife. 9, 51701 (2020).
- Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biology. 5, 11 (2007).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
- Buchman, A., et al. Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).
- Buchman, A., et al. Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody. PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103 (2020).
- Isaacs, A. T., et al. Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi. PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017 (2011).
- Liu, N., Li, T., Reid, W. R., Yang, T., Zhang, L. Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus. PloS One. 6 (8), 23403 (2011).
- Kauffman, E., et al. Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes. Bio Protocols. 7 (17), 2542 (2017).
- Richards, S. L., Anderson, S. L., Yost, S. A. Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1 (2012).
- Kitzmiller, J. B., Micks, D. W. Techniques for Rearing Culex Mosquitoes. American Midland Naturalist. 52 (1), 253 (1954).
- Mordue, A. J., Blackwell, A., Hansson, B. S., Wadhams, L. J., Pickett, J. A. Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae). Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).
- Allgood, D. W., Yee, D. A. Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation. Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), e56990 (2017).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).
- Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR. Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).
- Li, M., Bui, M., Yang, T., White, B. J., Akbari, O. S. Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).
- Li, M., et al. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).
- New England Biolabs Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclease I. NEB Available from: https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i (2020)
