Culex quinquefasciatus'ta Verimli Bölgeye Özgü Mutagenezi için Embriyo Mikroenjeksiyon Teknikleri
Summary
Bu protokol, CRISPR/Cas9 gen düzenleme araçlarıyla çalışmak üzere optimize edilmiş Culex quinquefasciatus embriyoları için mikroenjeksiyon prosedürlerini açıklar. Bu teknik, bu yetersiz hastalık vektörde genetik teknolojiler oluşturmak için kullanılabilecek bölgeye özgü, kalıtsal, germline mutasyonlarını verimli bir şekilde üretebilir.
Abstract
Culex quinquefasciatus, kuş sıtması, Batı Nil virüsü (WNV), Japon ensefalit, Doğu at ensefaliti, lenfatik filariasis ve Saint Louis ensefaliti gibi çeşitli vektör kaynaklı hastalıkların vektörüdür. Özellikle, kuş sıtması çok sayıda endemik ada kuşu türünün neslinin tükenmesinde önemli bir rol oynarken, WNV Amerika Birleşik Devletleri’nde önemli bir vektör kaynaklı hastalık haline gelmiştir. C. quinquefasciatus biyolojisi hakkında daha fazla bilgi edinmek ve genetik kontrol araç kutularını genişletmek için, bu türdeki genom mühendisliği için daha verimli ve uygun fiyatlı yöntemler geliştirmemiz gerekir. Bununla birlikte, Culex sivrisineklerine özgü bazı biyolojik özellikler, özellikle yumurta salları, genom mühendisliği için gerekli mikroenjeksiyon işlemlerinin yapılmasını zorlaştırmıştır. Bu zorlukları ele almak için, Culex sivrisineklerinin benzersiz özellikleriyle ilişkili teknik engelleri azaltmaya odaklanan optimize edilmiş bir embriyo mikroenjeksiyon protokolü geliştirdik. Bu prosedürler, C. quinquefasciatus’ta başarılı mikroenjeksiyon için gerekli olan yumurta toplama, yumurta salı ayırma ve diğer elleçleme prosedürleri için optimize edilmiş yöntemleri göstermektedir. CRISPR/Cas9 genom düzenleme teknolojisi ile birleştiğinde, bu prosedürler, bu önemli, ancak şu anda yetersiz olan hastalık vektöründe gelişmiş genom mühendisliği yapmak ve genetik kontrol teknolojileri geliştirmek için gerekli olan bölgeye özgü, verimli ve kalıtsal germline mutasyonları elde etmemizi sağlar.
Introduction
C. quinquefasciatus, genellikle güney evi sivrisinek olarak bilinen, Batı Nil virüsü (WNV), Japon ensefalit, Saint Louis ensefaliti ve Doğu at ensefaliti dahil olmak üzere çok sayıda patojenin yetkin bir vektörüdür. Özellikle, 1999’da New York’ta ilk kez tespit edildiğinden beri, WNV, 1999 ve 2018 yılları arasında yaklaşık 2.300 ölümle sonuçlanan 50.000’den fazla insan vakası ve 2008-2019 yılları arasında bildirilen 4.500’den fazla at vakası ile kıta Amerika Birleşik Devletleri (ABD) genelinde önemli bir vektör kaynaklı hastalık halinegelmiştir. Buna ek olarak, Kuzey Amerika’da bulunan en az 23 kuş türü, WNV3’ünbir sonucu olarak kurtarılamaz olarak sınıflandırılan en az 12 tür ile WNV enfeksiyonlarından etkilenmiştir. WNV’nin insan, at ve kuş popülasyonları üzerindeki etkisi, vektörlerinin fırsatçı beslenme davranışından kaynaklanmaktadır. Tipik olarak, kuşlar WNV için birincil konaktır ve insanlar ve atlar tesadüfi veya çıkmaz konaklardır. C. quinquefasciatus tarafından vektörlenen bazı patojenler sadece kuş sıtma paraziti, Plasmodium relictumgibi kuşları enfekte eder. Hawaii’de, C. quinquefasciatus kuş sıtmasının ana vektörüdür ve birçok yerli kuş türünün neslinin tükenmesine neden olmuştur4,5.
C. quinquefasciatustarafından bulaşan hastalıkları kontrol etmek için, araştırmacılar ve vektör kontrol ajansları insektisit uygulaması6gibi yaygın olarak kurulmuş sivrisinek popülasyon kontrol araçlarını kullanmıştır , ancak, bu yöntemler türlere özgü değildir ve birçok C. quinquefasciatus popülasyonunda insektisitlere karşı direnç yüksek olduğu için sınırlıetkilidir. Wolbachiatabanlı nüfus kontrol stratejileri gibi diğer kontrol teknikleri son yıllardageliştirilmiştir 10,11, ancak Wolbachia enfeksiyonu ile ilişkili fitness maliyetleri bu vektör için bu yaklaşımın fizibilitesini sınırlamak12. Aedes aegypti13 , 14, Anopheles gambiae15 ve Anopheles stephensi16gibi diğer sivrisinek türlerinde geliştirilen genetik tabanlı kontrol yöntemleri de vardır , patojene dirençli sivrisineklerin geliştirilmesi de dahil olmak üzere17,18,19, gerekli genom mühendisliği araçları ise C. quinquefasciatus için de geliştirilebilir bu tür için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, C. quinquefasciatus biyolojisi, bu vektörde benzer genetik teknolojilerin geliştirilmesini zorlaştıran diğer Aedes ve Anopheles sivrisinek vektörlerinden büyük ölçüde farklıdır. CRISPR tabanlı genom mühendisliği teknolojilerinin ortaya çıkmasıyla, hassas genom mühendisliği giderek daha önemsiz, uygun fiyatlı ve uyarlanabilir hale geldi ve sonuç olarak çok çeşitli türlerde yeni genetik araçların geliştirilmesine yol açtı.
CRISPR tabanlı teknolojilerle mutasyonlar üretmek için, istenen lociyi tamamlayan Cas9 proteini ve sentetik kılavuz RNA (sgRNA) karışımı, blastoderm öncesi evre embriyolara mikroenjakt edilir. C. quinquefasciatus dişileri yumurtalarını yüzen bir sal yapısına bağlı gruplar halinde bıraktıklarından (Şekil 1), Aedes ve Anopheles sivrisineklerinin bir özelliği olan ovipositing bireysel yumurtaların aksine, embriyo mikroenjections bu türlerde giderek daha karmaşık hale gelir. Culex larvaları da su yüzeyi ile temas halinde olan her yumurtanın ön tarafından ortaya çıkar (Şekil 1), bu nedenle yumurta yönelim sonrası manipülasyon bu türlerde önemlidir. Burada Cas9 proteini ve sgRNA’nın C. quinquefasciatus embriyolarına mikroenjeksiyonu için tasarlanmış ayrıntılı bir protokolü açıklıyoruz. Bu protokol, zamanında yumurta toplama ve yumurta hayatta kalma için anahtar olan belirli adımlarla embriyo sağkalım ve genom mutasyon oranlarını iyileştirmek için Culex biyolojisine özgü özellikleri barındıracak şekilde tasarlanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sivrisinek vektör kontrolü için genetik olarak tasarlanmış araçlar üretme çabalarıyla, yaygın sivrisinek hastalığı vektörleri için embriyo mikroenjeksiyon protokolleri geliştirmeye ve optimize etmeye ihtiyaç vardır. Aedes ve Anopheles sivrisinekleri için yöntemler geliştirilmiş olsa da, Culex için özel olarak tasarlanmış bir protokol minimal olarak araştırıldı. Genel olarak sivrisinek embriyo enjeksiyon protokolleri 3 genel adıma ayrılabilir: 1) embriyo toplama ve hazırlama, 2) embriyo enjeksiyonu ve 3) enjeksiyon sonrası iyileşme. Mutantların başarılı bir şekilde üretilebilmesi için, üç adımın da hedef türler için optimize edilmesi gerekir. Embriyo mikroenjeksiyon için bu değiştirilmiş protokol, Culex sivrisineklerinin başarılı genom mühendisliği için özeldir.
Embriyo toplamayı en üst düzeye çıkarmak embriyo mikroenjeksiyon protokollerinde yaygın bir darboğazdır. Kısa sürede toplanan yumurta sayısını artırmak için, sivrisinekler kan unu sonrası 2-3 gün boyunca bir yumurtlama substratından kısıtlandı. C. quinquefasciatus’un memeli kaynaklarının veya memeli kanıyla beslenen membranların aksine kuş kan kaynaklarını tercih etme eğiliminde olduğunu belirtmek önemlidir. Bununla birlikte, birçok araştırmacı kan beslemek için güvenilir bir canlı kuş veya kuş kanı kaynağı elde etmekte zorlanabilir, bu nedenle laboratuvar stokları daha erişilebilir kan kaynaklarıyla beslenmek için uyarlanabilir. C. quinquefasciatus ve diğer çoğu Culex vektörü için yumurtlama ipuçları sağladığından, yumurtlama substratı için besin bakımından zengin su kullanmak da çok önemlidir. Mikroenjeksiyon için uygun sayıda yumurtanın mevcut olduğundan emin olmak için laboratuvarlar arasında optimize edilmesi gerekebilecek besin bakımından zengin su üretmek için birçok yöntem vardır. Örneğin, bu yöntem 5 veya daha fazla gün boyunca deiyonize suda fermente edilen tavşan dışkısı ile en başarılı olsa da, diğer araştırmacılar besin kaynağı olarak ot veya balık yemi ve hatta bazıları damıtılmış su ile daha fazla başarıya sahiptir21.
Culex sivrisinekleri sallara yumurta grupları bıraktığından, yumurta toplamak oldukça basittir. Yumurtalar, tüm salı bir boya fırçasıyla kepçeleyarak basitçe toplanabilir. Yumurta ayrımı daha karmaşıktır, ancak başarılı enjeksiyon için gereklidir. Yumurtalar, boya fırçası veya toskun ile yumurtalar arasında hafif aşağı doğru basınç uygulanarak saldan dikkatlice ayrılabilir. Bazı uygulamalarla, birden fazla kullanıcı tek yumurtaları yumurta sallarından güvenilir bir şekilde ayırabildi. Her yumurtayı ayırdıktan sonra, yumurtalar mikroenjeksiyon sırasında yumurtaları stabilize eden çift taraflı yapışkan bantta aynı yönde hizalanır. Yumurtalar konik arka uca enjekte edilir ve halokarbon yağının eklenmesi, manipülasyon sırasında yumurtaları nemli tutar.
Mikroenjeksiyon sırasında embriyo hasarını sınırlamak için enjeksiyon iğnelerinin uygun mukavemete sahip olması ve uygun bir açıyla eğimli olması gerekir. 50° açıyla 10 saniye boyunca eğimli alümilikat iğneler en iyi sonuçlara sahipti, ancak borosilikat ve kuvars iğneler daha az dayanıklı ve daha pahalı olsalar da da çalışabilir. Ek olarak, uygun iğne eğimi Cas9 ve sgRNA karışımlarının daha iyi akışını kolaylaştırır ve embriyoya daha kolay nüfuz etmek için daha keskin bir nokta oluşturur. Çoğu durumda, eğim, tıkanmış iğneleri değiştirmek için zaman ve çaba harcamak yerine tıkanmış iğneleri hızlı bir şekilde düzeltmenin etkili bir yoludur.
Enjeksiyondan sonra, yumurtalar en az 5 dakika bozulmadan kalmalı ve halokarbon yağı hemen ardından temiz bir boya fırçası ile hafifçe fırçalanarak çıkarılmalıdır. Halokarbon yağının çıkarılmasından sonra, enjekte edilen yumurtalar, tipik olarak enjeksiyondan sonraki 3 gün içinde meydana gelen yumurtadan çıkmak için suya yerlenebilir. Pratik ve yeterli sayıda yumurta ile, bu protokol C. quinquefasciatus’ta tutarlı somatik ve germline mutasyonları elde edebilir ve diğer Culex sivrisineklerine kolayca adapte olması gereken kadar çok yönlüdür.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen O.S.A.’ya yönlendirilen UCSD başlangıç fonları tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 9 oz clear plastic pet cup | Karat | C-KC9 | Insect Rearing and Egg Collection |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate |
| Blood | Colorado Serum Company | 31025 | The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection. |
| Bugdorm | Bugdorm | 4F2222 | Insect Rearing Cage |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | Microinjection |
| Compound Microscope | Olympus BX41 | Microinjection, for embryo injection | |
| Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | Microinjection, to be used with beveler |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Microinjection |
| Double-sided Tape | Scotch | B084NVQGXD | Microinjection, embryo alignment |
| Femtojet 4x or 4i programmable microinjector | Eppendorf | Microinjection | |
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | Microinjection |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Microinjection, embryo collection |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | Microinjection, embryo alignment |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773 | Microinjection, embryo alignment |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | Microinjection, embryo alignment |
| Hemotek | Hemotek | PS5 | Line Maintenance |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | Microinjection, needle beveling |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | Microinjection, needle pulling |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | Microinjection, embryo alignment |
| Non-Drying Modeling Clay | Jovi | B0025Z71IM | Microinjection, needle storage |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | Microinjection, for embryo alignment |
| Sugar | Domino | 20% sugar solution for adult sugar source. | |
| T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Preparation of microinjection materials |
| TOPO TA Cloning Kit | ThermoFischer Scientific | K451020 | Preparation of microinjection materials |
| Ultra-fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | Microinjection, embryo alignment |
References
- Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC Available from: https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight (2019)
- APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA Available from: https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv (2020)
- Luke George, T., et al. Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).
- van Riper, C., van Riper, S. G., Lee Goff, M., Laird, M. The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds. Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).
- Liao, W., Atkinson, C. T., LaPointe, D. A., Samuel, M. D. Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change. PloS One. 12 (1), 0168880 (2017).
- Martins, W. F. S., et al. Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 9 (1), 11406 (2019).
- Norris, L. C., Norris, D. E. Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia. Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).
- Corbel, V., et al. Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa. Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).
- Yadouléton, A., et al. Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin. Parasites & Vectors. 8, 17 (2015).
- Atyame, C. M., et al. Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions. PloS One. 10 (3), 0119288 (2015).
- Atyame, C. M., et al. Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440 (2011).
- Almeida, F., et al. Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae). Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).
- Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife. 9, 51701 (2020).
- Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biology. 5, 11 (2007).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
- Buchman, A., et al. Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).
- Buchman, A., et al. Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody. PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103 (2020).
- Isaacs, A. T., et al. Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi. PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017 (2011).
- Liu, N., Li, T., Reid, W. R., Yang, T., Zhang, L. Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus. PloS One. 6 (8), 23403 (2011).
- Kauffman, E., et al. Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes. Bio Protocols. 7 (17), 2542 (2017).
- Richards, S. L., Anderson, S. L., Yost, S. A. Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1 (2012).
- Kitzmiller, J. B., Micks, D. W. Techniques for Rearing Culex Mosquitoes. American Midland Naturalist. 52 (1), 253 (1954).
- Mordue, A. J., Blackwell, A., Hansson, B. S., Wadhams, L. J., Pickett, J. A. Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae). Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).
- Allgood, D. W., Yee, D. A. Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation. Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), e56990 (2017).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).
- Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR. Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).
- Li, M., Bui, M., Yang, T., White, B. J., Akbari, O. S. Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).
- Li, M., et al. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).
- New England Biolabs Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclease I. NEB Available from: https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i (2020)
