Методы микроинъекции эмбрионов для эффективного сайт-специфического мутагенеза при Culex quinquefasciatus
Summary
Этот протокол описывает процедуры микроинъекции для эмбрионов Culex quinquefasciatus, которые оптимизированы для работы с инструментами редактирования генов CRISPR / Cas9. Этот метод может эффективно генерировать специфические для сайта, наследственные мутации зародышевой линии, которые могут быть использованы для создания генетических технологий у этого недостаточно изученного переносчика болезней.
Abstract
Culex quinquefasciatus является переносчиком разнообразного спектра трансмиссивных заболеваний, таких как птичья малярия, вирус Западного Нила (ВЗН), японский энцефалит, восточный конский энцефалит, лимфатический филяриоз и энцефалит Сент-Луиса. Примечательно, что птичья малярия сыграла важную роль в исчезновении многочисленных эндемичных островных видов птиц, в то время как ВЗН стала важным трансмиссивным заболеванием в Соединенных Штатах. Чтобы получить дальнейшее представление о биологии C. quinquefasciatus и расширить их набор инструментов генетического контроля, нам необходимо разработать более эффективные и доступные методы геномной инженерии у этого вида. Тем не менее, некоторые биологические признаки, уникальные для комаров Culex, особенно их яичные плоты, затруднили выполнение процедур микроинъекции, необходимых для геномной инженерии. Для решения этих проблем мы разработали оптимизированный протокол микроинъекции эмбриона, который фокусируется на смягчении технических препятствий, связанных с уникальными характеристиками комаров Culex. Эти процедуры демонстрируют оптимизированные методы сбора яиц, разделения плотов и других процедур обработки, необходимых для успешной микроинъекции C. quinquefasciatus. В сочетании с технологией редактирования генома CRISPR / Cas9 эти процедуры позволяют нам достигать специфических для сайта, эффективных и наследственных мутаций зародышевой линии, которые необходимы для выполнения передовой геномной инженерии и разработки технологий генетического контроля в этом важном, но в настоящее время недостаточно изученном переносчике болезни.
Introduction
C. quinquefasciatus,широко известный как южный домашний комар, является компетентным переносчиком многочисленных патогенов, включая вирус Западного Нила (ВЗН), японский энцефалит, энцефалит Сент-Луиса и восточный конский энцефалит. В частности, с тех пор, как ВЗН была впервые обнаружена в Нью-Йорке в 1999 году, ВЗН стала основным трансмиссивным заболеванием на всей континентальной части Соединенных Штатов (США), где зарегистрировано более 50 000 случаев заболевания людей, в результате чего в период с 1999 по 2018 год погибло около 2 300 человек1, а также более 4 500 зарегистрированных случаев заболевания лошадей в период с 2008 по 2019год2. Кроме того, по меньшей мере 23 вида птиц, обнаруженных в Северной Америке, подверглись воздействию инфекций ВЗН, причем по меньшей мере 12 видов классифицированы как невосполнимые в результате ВЗН3. Влияние ВЗН на популяции людей, лошадей и птиц обусловлено оппортунистическим пищевым поведением его переносчиков. Как правило, птицы являются основными хозяевами для ВЗН, а люди и лошади являются случайными или тупиковыми хозяевами. Некоторые патогены, переносимые C. quinquefasciatus, заражают только птиц, таких как паразит птичьей малярии, Plasmodium relictum. На Гавайях C. quinquefasciatus является основным переносчиком птичьей малярии и вызвал вымирание многих местных видов птиц4,5.
Для борьбы с болезнями, передаваемыми C. quinquefasciatus,исследователи и агентства по борьбе с переносчиками использовали широко установленные инструменты борьбы с популяцией комаров, такие как применение инсектицидов6,однако эти методы являются дорогостоящими, не видоспецифичными и имеют ограниченную эффективность, поскольку устойчивость к инсектицидам высока во многих популяциях C. quinquefasciatus 6,7,8,9. Другие методы контроля, такие как стратегии контроля популяции на основе Wolbachia,были разработаны в последние годы10,11,но затраты на приспособленность, связанные с инфекцией Wolbachia, ограничивают осуществимость этого подхода для этого вектора12. Существуют также генетически обоснованные методы борьбы, которые были разработаны у других видов комаров, таких как Aedes aegypti13,14, Anopheles gambiae15 и Anopheles stephensi16,включая развитие устойчивых к патогенам комаров17,18,19,которые также могут быть разработаны для C. quinquefasciatus, если необходимые инструменты геномной инженерии разработан для этого вида. Однако биология C. quinquefasciatus сильно отличается от других комаров-переносчиков Aedes и Anopheles, что затрудняет разработку подобных генетических технологий в этом векторе. С появлением технологий геномной инженерии на основе CRISPR точная геномная инженерия становится все более тривиальной, доступной и адаптируемой и, следовательно, привела к разработке новых генетических инструментов для широкого спектра видов.
Для генерации мутаций с помощью технологий на основе CRISPR смесь белка Cas9 и синтетической направляющей РНК (sgRNA), комплементарной к желаемым локам, микроинъектируется в эмбрионы до бластодермной стадии. Поскольку самки C. quinquefasciatus откладывают яйца группами, прикрепленными в плавающую плотовую структуру(рисунок 1),в отличие от яйцекладущих отдельных яиц, черта комаров Aedes и Anopheles, микроинъекции эмбрионов у этого вида становятся все более сложными. Личинки кулекса также выходят с передней стороны каждого яйца, которая находится в контакте с поверхностьюводы (рисунок 1),поэтому у этого вида важны манипуляции с ориентацией яиц. Здесь мы опишем подробный протокол, предназначенный для микроинъекции белка Cas9 и sgRNA в эмбрионы C. quinquefasciatus. Этот протокол был разработан для учета признаков, уникальных для биологии Culex, чтобы улучшить выживаемость эмбрионов и частоту мутаций генома с помощью определенных шагов, которые являются ключевыми для своевременного сбора яйцеклеток и выживания яйцеклеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
В связи с недавними усилиями по созданию генетически модифицированных инструментов для борьбы с переносчиками комаров возникла необходимость в разработке и оптимизации протоколов микроинъекции эмбрионов для распространенных переносчиков болезней комаров. Хотя методы были разработаны для комаров Aedes и Anopheles, протокол, разработанный специально для Culex, был минимально изучен. В целом протоколы инъекций эмбрионов комаров можно разделить на 3 общих этапа: 1) сбор и подготовка эмбриона, 2) инъекция эмбриона и 3) восстановление после инъекции. Чтобы успешно генерировать мутантов, все три шага должны быть оптимизированы для целевых видов. Этот модифицированный протокол микроинъекции эмбриона является специфическим для успешной геномной инженерии комаров Culex.
Максимизация сбора эмбрионов является распространенным узким местом в протоколах микроинъекции эмбрионов. Чтобы увеличить количество яиц, собранных за короткий промежуток времени, комаров ограничили от субстрата яйцекладки в течение 2-3 дней после приема пищи с кровью. Важно отметить, что C. quinquefasciatus, как правило, предпочитает источники крови птиц, а не источники млекопитающих или мембранное питание кровью млекопитающих. Тем не менее, многие исследователи испытывают трудности с приобретением надежного источника живых птиц или птичьей крови для кормления кровью, поэтому лабораторные запасы могут быть адаптированы для питания более доступными источниками крови. Также важно использовать богатую питательными веществами воду для яйцекладки субстрата, поскольку она обеспечивает сигналы яйцекладки для C. quinquefasciatus и большинства других векторов Culex. Существует множество методов получения богатой питательными веществами воды, которые, возможно, потребуется оптимизировать между лабораториями, чтобы обеспечить наличие соответствующего количества яиц для микроинъекции. Например, в то время как этот метод был наиболее успешным с фекалиями кроликов, ферментированными в деионизированной воде в течение 5 или более дней, другие исследователи имеют больший успех с травяной или рыбной пищей в качестве источника питательных веществ, а некоторые даже с дистиллированной водой21.
Поскольку комары Culex откладывают группы яиц на плотах, собрать яйца довольно просто. Яйца можно просто собрать, зачерпнуть весь плот кистью. Разделение яйцеклеток является более сложным, но необходимым для успешной инъекции. Яйца можно осторожно отделить от плота, применяя мягкое давление вниз между яйцами кистью или щипцами. С некоторой практикой несколько пользователей смогли надежно отделить одно яйцо от яичных плотов. После разделения каждого яйца яйца выравниваются в одинаковой ориентации на двусторонней липкой ленте, которая стабилизирует яйца во время микроинъекции. Яйца вводятся в конический задний конец, а добавление галоуглеродного масла сохраняет яйца влажными во время манипуляции.
Чтобы ограничить повреждение эмбриона во время микроинъекции, инъекционные иглы должны быть соответствующей прочности и скошены под соответствующим углом. Алюмосиликатные иглы, скошенные в течение 10 секунд под углом 50°, имели наилучшие результаты, но боросиликатные и кварцевые иглы также могут работать, даже если они могут быть менее прочными и более дорогими. Кроме того, правильная скос игла облегчает лучшее протекание смесей Cas9 и sgRNA и создает более острую точку для более легкого проникновения в эмбрион. Во многих случаях скос также является эффективным способом быстрого исправления забитых игл вместо того, чтобы тратить время и усилия на замену забитых игл.
После инъекции яйца должны оставаться нетронутыми в течение не менее 5 минут, а галогенуглеродное масло удаляется сразу после этого, аккуратно смахивая его чистой кистью. После удаления галоуглеродного масла введенные яйца могут быть помещены в воду для вылупления, что обычно происходит в течение 3 дней после инъекции. При наличии практики и достаточного количества яиц этот протокол может достичь последовательных соматических и зародышевых мутаций у C. quinquefasciatus и является достаточно универсальным, чтобы его можно было легко адаптировать к другим комарам Culex.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана стартовыми фондами UCSD, направленными в O.S.A.
Materials
| 9 oz clear plastic pet cup | Karat | C-KC9 | Insect Rearing and Egg Collection |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate |
| Blood | Colorado Serum Company | 31025 | The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection. |
| Bugdorm | Bugdorm | 4F2222 | Insect Rearing Cage |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | Microinjection |
| Compound Microscope | Olympus BX41 | Microinjection, for embryo injection | |
| Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | Microinjection, to be used with beveler |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Microinjection |
| Double-sided Tape | Scotch | B084NVQGXD | Microinjection, embryo alignment |
| Femtojet 4x or 4i programmable microinjector | Eppendorf | Microinjection | |
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | Microinjection |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Microinjection, embryo collection |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | Microinjection, embryo alignment |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773 | Microinjection, embryo alignment |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | Microinjection, embryo alignment |
| Hemotek | Hemotek | PS5 | Line Maintenance |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | Microinjection, needle beveling |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | Microinjection, needle pulling |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | Microinjection, embryo alignment |
| Non-Drying Modeling Clay | Jovi | B0025Z71IM | Microinjection, needle storage |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | Microinjection, for embryo alignment |
| Sugar | Domino | 20% sugar solution for adult sugar source. | |
| T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Preparation of microinjection materials |
| TOPO TA Cloning Kit | ThermoFischer Scientific | K451020 | Preparation of microinjection materials |
| Ultra-fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | Microinjection, embryo alignment |
References
- Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC Available from: https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight (2019)
- APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA Available from: https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv (2020)
- Luke George, T., et al. Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).
- van Riper, C., van Riper, S. G., Lee Goff, M., Laird, M. The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds. Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).
- Liao, W., Atkinson, C. T., LaPointe, D. A., Samuel, M. D. Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change. PloS One. 12 (1), 0168880 (2017).
- Martins, W. F. S., et al. Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 9 (1), 11406 (2019).
- Norris, L. C., Norris, D. E. Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia. Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).
- Corbel, V., et al. Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa. Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).
- Yadouléton, A., et al. Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin. Parasites & Vectors. 8, 17 (2015).
- Atyame, C. M., et al. Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions. PloS One. 10 (3), 0119288 (2015).
- Atyame, C. M., et al. Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440 (2011).
- Almeida, F., et al. Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae). Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).
- Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife. 9, 51701 (2020).
- Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biology. 5, 11 (2007).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
- Buchman, A., et al. Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).
- Buchman, A., et al. Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody. PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103 (2020).
- Isaacs, A. T., et al. Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi. PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017 (2011).
- Liu, N., Li, T., Reid, W. R., Yang, T., Zhang, L. Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus. PloS One. 6 (8), 23403 (2011).
- Kauffman, E., et al. Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes. Bio Protocols. 7 (17), 2542 (2017).
- Richards, S. L., Anderson, S. L., Yost, S. A. Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1 (2012).
- Kitzmiller, J. B., Micks, D. W. Techniques for Rearing Culex Mosquitoes. American Midland Naturalist. 52 (1), 253 (1954).
- Mordue, A. J., Blackwell, A., Hansson, B. S., Wadhams, L. J., Pickett, J. A. Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae). Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).
- Allgood, D. W., Yee, D. A. Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation. Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), e56990 (2017).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).
- Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR. Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).
- Li, M., Bui, M., Yang, T., White, B. J., Akbari, O. S. Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).
- Li, M., et al. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).
- New England Biolabs Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclease I. NEB Available from: https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i (2020)
