キュレックス・キンケファシアトゥスにおける効率的な部位特異的変異誘発のための胚微小注入技術

1. C. クィケファシアトゥス コロニー飼育 バグ寮ケージに C.キンケファシアトゥス 大人の複数のコロニーを設定します。注:コロニーはコーネル大学20でローラ・ハリントン博士によって提供されました。 Culex 蚊を飼育するための詳細なプロトコルは、他の文献21で見つけることができます。 12:12時間の昼/夜サイクルで湿度30%で25±1 °Cで蚊を維持します。 20%の砂糖溶液のアドリビタムを提供し、芯を入れた砂糖溶液容器をケージに入れるか、または綿ボールを砂糖溶液で飽和させ、ケージ内に入れます。 蚊が血液を摂食する前に少なくとも3日間交尾することを許可する(図2A)。 2. C.キンケファシアトゥス プレブラコデドム期胚の収集 3〜6日後のエローションの後、女性に、合成膜を通して1〜2mLのクビシ血液食を与え、血液供給システムで約40°Cに加熱した(図2B)。また、Culex蚊に使用できる代替の血液供給プロトコルもあります(例えば、ref21を参照してください)。注:C.キンケファシアトゥスは、鳥の血液の好みで知られています。いくつかの研究室は、血液の食事源21、22、23のために麻酔を受けた生きた鳥や鳥の血液を使用しています。しかし、この機能が複数の世代にわたって選択されている場合、コロニーはウシの血液または小さなげっ歯類を食べるように訓練/選択することができます。 女性は、マイクロインジェクション実験のための卵子を誘発する前に、卵の発生と卵の成熟を受けるために、血液の供給後に最低3日間休むことを可能にします。 胚性マイクロインジェクションの日に、有機的に注入された卵子水で卵子カップを作成します。卵子水は、ウサギの便(50 g/L)、草(4.5 g/L)、または魚の食べ物(25g/L)を5日以上の間に水に分解することによって作られるべきです。 オビポジションカップをケージに入れ、ケージ全体を暗い場所に置きます(図2C)。 30分ごとに、カップに卵のいかだがないか確認してください。 卵のいかだが存在する場合は、ペイントブラシでそれらをすくっていかだを収集し、ウェットフィルター紙の上に置きます(図2D,E)。 3. C.クムケファシアトゥスプレブラスターデドム期胚のアライメント いかだを押し下げて、細かい先端のペイントブラシと鉗子を使って卵を個別に引き離して、いかだから卵を分離します(図2E)。 ガラススライドの上部に置かれた両面付箋テープの薄いストリップに個々の卵を揃える(図2F)。 整列しながら、アクセシビリティを容易にするために、各卵の前側を同じ方向に向けてみてください。注:両面付き粘着テープを使用しない代替卵アライメント方法は、以前に公開された ナソニアビトリペニス 胚マイクロインジェクションプロトコル26で見つけることができます。 ハロカーボンオイルミックスで卵を覆います。注:ハロカーボンミックスは、2つのハロカーボン試薬と水(9:1:20、ハロカーボン700:ハロカーボン27:超純水)を穏やかに混合し、25°Cで一晩インキュベートしてハロカーボンオイルの水飽和を容易にすることによって、事前に調製することができます。 4. マイクロインジェクション用の針の準備 ガラスマイクロピペットプーラーを使用して、アルミノケイ酸キャピラリーガラス針を生成します。 針の引き手のユーザーマニュアルからの指示に従って、アルミノケイ酸キャピラリーガラスを針の引き手に入れます。注:石英およびホウケイ酸毛細血管針も使用できますが、この実験では、アルミノケイ酸塩は相対的な手頃な価格と耐久性のために好まれます。 [熱]を 516、速度を 100 に、[遅延] を 70 に、[97 にプル]、および [圧力] をニードル プーラーで 500 に設定します。 引き手の指示に従って針の引き手を作動させ、追加の針のために必要に応じて繰り返します。注: 注射プロセス中に針が詰まったり、誤って壊れたりすることが多いため、1 回の実験で追加の針を引っ張ることを強くお勧めします。 回転するダイヤモンドの研磨板の上で、50°の角度で約10sのプル針の先端にそっと触れることで、針先をベベルします。注:針をベベルすると、液体が流れるように開き、胚への浸透を容易にするためにより鋭い先端を作成します。適切な針の例は、前の記事26で見ることができます。 ペトリ皿のモデラーの粘土のラインに埋め込むことによって、針を引っ張ってベベリングした針を保管してください。注:針の先端のための最高の品質を確保するために、針は、注射の時間にできるだけ近い、新鮮に引っ張られ、ベベにする必要があります。 5. 注入混合物のロード ゲノム修飾試薬(例えば、200 ng/μL sgRNAおよび200 ng/μL Cas9混合物)からなる注入混合物を準備するか、または好ましい注入溶液を氷の上に保つ。注:このミックスは、卵が産まれるのを待っている間に準備することができます。Cas9 および sgRNA の生産とマイクロインジェクションの準備の詳細については、前の出版物27,28,29,30を参照してください。 マイクロローダーチップを使用して注射針に2μLの注入混合物をロードします。 6. マイクロインジェクションのセットアップ 充填された注射針を、電子マイクロインジェクターにリンクされたマイクロマニピュレータセットに入れる。 コンパウンド顕微鏡のステージ上に、整列した卵を含むガラススライドを置きます。 マイクロマニピュレーターと複合顕微鏡を使用して、針を合わせて、25~35°の角度で胚の後端を目指します。 7. 胚マイクロインジェクション(図2G) 慎重に針を胚に挿入し、胚の体積の約10%の量(卵の大きさに応じて700〜800 pL)の混合物を注入する。注:注入すると、卵はわずかに膨らむはずですが、あまりにも多くの液体を注入すると、卵が破裂したり、細胞質流体が漏れたりすることがあります。 一度に約20個の卵を注入し、停止して胚の回復手順を実行します。注:注射中に、針が詰まったり壊れたりする可能性が高くなります。詰まりが発生した場合は、注射液が針を流れる不足によって判断される可能性があり、電子マイクロインジェクターのクリーン機能で針を掃除するか、針を再びベベリングしてみてください。どちらのステップもうまくいかない場合は、準備された卵が湿ったままであることを確認しながら、すぐに新しい針に変更します。 8. 胚の回復と孵化 卵を少なくとも5分間邪魔しません。20分以内に、きれいなペイントブラシで軽くブラッシングしてハロカーボンオイルを慎重に取り除きます(図2H)。 卵をペイントブラシでやさしく持ち上げ、二重蒸留水のカップに入れます(図2I)。水面に卵を保管するように注意してください。 卵が孵化するために毎日7日間チェックしてください(図2J)。 通常の幼虫飼育手順21に従ってください。 9. ゲノム改変のスクリーニング ステレオスコープを使用して、突然変異型のフェノタイプのために注入された蚊をスクリーニングする(図2K)。 容易に認識可能な表現型を有しない突然変異を検証し、PCR増幅により、T7エンドヌクレアーゼIアッセイ、および標的領域31のサブクローニングによるシーケンシングを行う。 生殖細胞系列内の遺伝性突然変異を検出するために注入された個人間の追加の十字架を設定します。.