Techniques de microinjection embryonnaire pour une mutagénèse efficace spécifique au site chez Culex quinquefasciatus

1. Élevage de colonies de C. quinquefasciatus Installez plusieurs colonies d’adultes de C. quinquefasciatus dans des cages à insectes.NOTE: Les colonies ont été fournies par la Dre Laura Harrington à l’Université Cornell20. Des protocoles détaillés pour l’élevage des moustiques Culex peuvent être trouvés dans d’autrespublications 21. Maintenez les moustiques à 25 ± 1 °C à 30% d’humidité avec un cycle jour/nuit de 12:12 h. Fournissez une solution de sucre à 20% ad libitum en introduisant un récipient de solution de sucre avec une mèche dans la cage ou en saturant des boules de coton avec la solution de sucre et en la plaçant dans la cage. Laissez les moustiques s’accoupler pendant au moins 3 jours avant l’alimentation sanguine (Figure 2A). 2. Collection d’embryons de C. quinquefasciatus au stade pré-blastodermique Après 3 à 6 jours après l’eclosion, fournir aux femelles 1 à 2 mL d’une farine de sang bovine citrée à travers une membrane synthétique et chauffée à environ 40 °C dans un système d’alimentation sanguine (Figure 2B). Il existe également d’autres protocoles d’alimentation sanguine qui peuvent être utilisés pour les moustiques Culex (par exemple, voir ref21).REMARQUE: C. quinquefasciatus est connu pour une préférence pour le sang aviaire. Certains laboratoires utilisent des oiseaux vivants anesthésiés ou du sang aviaire pour leur source de farine de sang21,22,23. Cependant, les colonies peuvent être entraînées/sélectionnées pour se nourrir de sang bovin ou de petits rongeurs si cette caractéristique est sélectionnée pour plusieurs générations. Laissez les femelles se reposer pendant au moins 3 jours après l’alimentation sanguine pour subir une oogenèse et une maturation des œufs avant d’induire une ponte pour des expériences de micro-injection. Le jour des microinjections embryonnaires, créez une tasse de ponte avec de l’eau de ponte infusée organiquement. L’eau de ponte doit être faite en fermentant les excréments de lapin (50 g / L), en décomposant l’herbe (4,5 g / L) ou la nourriture pour poissons (25 g / L) dans l’eau au cours de 5 jours ou plus24,25. Placez la coupe de ponte dans la cage et placez la cage entière dans un endroit sombre (Figure 2C). Après toutes les 30 minutes, vérifiez la tasse pour les radeaux d’œufs. Si des radeaux d’œufs sont présents, ramassez les radeaux en les ramassant avec un pinceau et placez-les sur un papier filtre humide (Figure 2D,E). 3. Alignement des embryons au stade pré-blastodermique de C. quinquefasciatus Séparez les œufs des radeaux en appuyant sur le radeau et en les séparant individuellement à l’aide d’un pinceau à pointe fine et d’une pince (Figure 2E). Aligner les œufs individuels sur une fine bande de ruban adhésif double face placée sur le dessus d’une glissière de verre (Figure 2F). Tout en alignant, essayez de pointer le côté antérieur de chaque œuf dans la même direction pour une accessibilité plus facile.REMARQUE: Une méthode alternative d’alignement des ovules sans ruban adhésif double face peut être trouvée dans un protocole de micro-injection embryonnaire de Nasonia vitripennis précédemment publié26. Couvrir les œufs avec le mélange d’huile d’halocarbure.REMARQUE: Le mélange d’halocarbures peut être préparé à l’avance en mélangeant doucement deux réactifs halocarbonés et de l’eau (9:1:20, halocarbure 700: halocarbone 27: eau ultrapure), puis en incubant le mélange pendant la nuit à25°Cpour faciliter la saturation en eau de l’huile d’halocarbure. 4. Préparation à l’aiguille pour les microinjections Générez les aiguilles de verre capillaire aluminosilicate à l’aide d’un arracheur de micropipette en verre. Placez un verre capillaire aluminosilicate dans un arracheur d’aiguilles, conformément aux instructions du manuel d’utilisation de l’arracheur d’aiguilles.REMARQUE: Des aiguilles capillaires en quartz et en borosilicate peuvent également être utilisées, mais pour cette expérience, l’aluminosilicate est préféré en raison de son prix relativement abordable et de sa durabilité. Réglez la chaleur sur 516, la vitesse sur 100, le retard sur 70, la traction sur 97 et la pression sur 500 sur l’arracheur d’aiguilles. Activez l’arracheur d’aiguilles, conformément aux instructions de l’arracheur et répétez au besoin pour des aiguilles supplémentaires.REMARQUE: Pendant le processus d’injection, les aiguilles se bouchent souvent ou se cassent accidentellement, par conséquent, il est fortement recommandé de tirer des aiguilles supplémentaires pour une seule expérience. Biseautez la pointe de l’aiguille en touchant doucement la pointe de l’aiguille tirée sur la plaque abrasive diamantée rotative pendant environ 10 s à un angle de 50°.REMARQUE: Le biseautage de l’aiguille l’ouvre pour permettre au liquide de circuler tout en créant une pointe plus nette pour une pénétration plus facile dans l’embryon. Un exemple d’aiguille appropriée peut être vu dans un article précédent26. Rangez les aiguilles tirées et biseautées en les incorporant dans des lignes d’argile de modéliste dans une boîte de Pétri.REMARQUE: Pour assurer la meilleure qualité pour les pointes d’aiguilles, les aiguilles doivent être fraîchement tirées et biseautées aussi près que possible du moment de l’injection. 5. Chargement du mélange d’injection Préparer le mélange injectable composé de réactifs de modification du génome (p. ex., 200 ng/μL d’ARNs sg et 200 ng/μL de mélange Cas9), ou de solutions d’injection préférées et le conserver sur la glace.REMARQUE: Ce mélange peut être préparé en attendant que les œufs soient pondus. Plus de détails sur la production de Cas9 et d’ARNg et la préparation à la microinjection peuvent être trouvés dans les publications précédentes27,28,29,30. Chargez 2 μL de mélange d’injection dans l’aiguille d’injection à l’aide d’une pointe de microchargeur. 6. Mise en place de la micro-injection Placez l’aiguille d’injection remplie dans un micromanipulateur mis en place relié à un micro-injecteur électronique. Placez la lame de verre contenant les œufs alignés sur la scène d’un microscope composé. À l’aide du micromanipulateur et du microscope composé, alignez l’aiguille pour viser l’extrémité postérieure de l’embryon à un angle de 25 à 35 °. 7. Microinjection embryonnaire (Figure 2G) Insérez soigneusement l’aiguille dans l’embryon et injectez le mélange à une quantité d’environ 10% du volume de l’embryon (700-800 pL selon la taille des ovules).REMARQUE: Lors de l’injection, l’œuf devrait légèrement gonfler, cependant, si trop de liquide est injecté, les œufs peuvent éclater ou le liquide cytoplasmique peut s’échapper. Injectez environ 20 ovules à la fois, puis arrêtez et effectuez des procédures de récupération d’embryons.REMARQUE: Lors de l’injection, il y a un risque élevé que les aiguilles se bouchent ou se cassent. Si un bouchon se produit, ce qui peut être déterminé par un manque de liquide d’injection circulant à travers l’aiguille, essayez soit de nettoyer l’aiguille avec la fonction de nettoyage sur le micro-injecteur électronique, soit d’essayer de re-biseauter l’aiguille. Si aucune des deux étapes ne fonctionne, changez rapidement pour une nouvelle aiguille tout en vous assurant que les œufs préparés restent humidifiés. 8. Récupération et éclosion des embryons Laissez les œufs intacts pendant au moins 5 min. Dans les 20 minutes suivant l’injection, retirez soigneusement l’huile d’halocarbure en brossant légèrement avec un pinceau propre(Figure 2H). Soulevez doucement les œufs à l’aide d’un pinceau et placez-les dans une tasse d’eau double distillée(Figure 2I). Prenez soin de garder les œufs à la surface de l’eau. Vérifiez les œufs tous les jours pendant 7 jours pour l’éclosion (Figure 2J). Suivre les procédures normales d’élevagelarvaire 21. 9. Dépistage de la modification du génome Dépister les moustiques injectés pour les phénotypes mutants à l’aide d’un stéréoscope (Figure 2K). Vérifier les mutations qui n’ont pas un phénotype facilement reconnaissable, par amplification PCR, dosage de l’endonucléase I T7 et séquençage par sous-clonage de la région cible31. Mettre en place des croisements supplémentaires entre les individus injectés pour détecter les mutations héréditaires dans la lignée germinale.