Embryo micro-injection technieken voor efficiënte site-specifieke mutagenese in Culex quinquefasciatus
Summary
Dit protocol beschrijft micro-injectieprocedures voor Culex quinquefasciatus embryo’s die zijn geoptimaliseerd om te werken met CRISPR/Cas9 genbewerkingstools. Deze techniek kan efficiënt site-specifieke, erfelijke, kiembaanmutaties genereren die kunnen worden gebruikt voor het bouwen van genetische technologieën in deze onderbelichte ziektevector.
Abstract
Culex quinquefasciatus is een vector van een breed scala aan vector-overgedragen ziekten zoals aviaire malaria, West Nile virus (WNV), Japanse encefalitis, Oostelijke paardenencefalitis, lymfatische filariasis en Saint Louis encefalitis. Met name aviaire malaria heeft een belangrijke rol gespeeld bij het uitsterven van talrijke endemische eilandvogelsoorten, terwijl WNV een belangrijke vectorziekte is geworden in de Verenigde Staten. Om meer inzicht te krijgen in de biologie van C. quinquefasciatus en hun genetische controletoolbox uit te breiden, moeten we efficiëntere en betaalbare methoden ontwikkelen voor genoomtechniek bij deze soort. Sommige biologische eigenschappen die uniek zijn voor Culex-muggen, met name hun eiervlotten, hebben het echter moeilijk gemaakt om micro-injectionprocedures uit te voeren die nodig zijn voor genoomtechniek. Om deze uitdagingen aan te pakken, hebben we een geoptimaliseerd embryomicro-injectieprotocol ontwikkeld dat zich richt op het verminderen van de technische obstakels die verband houden met de unieke kenmerken van Culex-muggen. Deze procedures tonen geoptimaliseerde methoden voor het verzamelen van eieren, het scheiden van eiervlotten en andere behandelingsprocedures die essentieel zijn voor een succesvolle micro-injection bij C. quinquefasciatus. In combinatie met de CRISPR/Cas9 genoombewerkingstechnologie stellen deze procedures ons in staat om sitespecifieke, efficiënte en erfelijke kiembaanmutaties te bereiken, die nodig zijn om geavanceerde genoomengineering uit te voeren en genetische controletechnologieën te ontwikkelen in deze belangrijke, maar momenteel onderbelichte ziektevector.
Introduction
C. quinquefasciatus, algemeen bekend als de zuidelijke huismug, is een competente vector van talrijke pathogenen, waaronder het West Nile-virus (WNV), Japanse encefalitis, Saint Louis-encefalitis en oostelijke paardenencefalitis. In het bijzonder, sinds het voor het eerst werd ontdekt in New York in 1999, is WNV een belangrijke door vectoren overgedragen ziekte geworden in de continentale Verenigde Staten (VS) met meer dan 50.000 gemelde menselijke gevallen die resulteerden in ongeveer 2.300 sterfgevallen tussen 1999 en 20181 en meer dan 4.500 gemelde paardengevallen tussen 2008-20192. Bovendien zijn ten minste 23 vogelsoorten die in Noord-Amerika zijn aangetroffen, getroffen door WNV-infecties met ten minste 12 soorten die als onherstelbaar zijn geclassificeerd als gevolg van WNV3. De impact van WNV op menselijke, paarden- en vogelpopulaties is te wijten aan het opportunistische voedingsgedrag van de vectoren. Meestal zijn vogels de primaire gastheren voor WNV en zijn mensen en paarden incidentele of doodlopende gastheren. Sommige pathogenen gevectoreerd door C. quinquefasciatus infecteren alleen vogels zoals de aviaire malariaparasiet, Plasmodium relictum. In Hawaï is C. quinquefasciatus een belangrijke vector van aviaire malaria en heeft het uitsterven van veel inheemse vogelsoorten veroorzaakt4,5.
Om ziekten te bestrijden die worden overgedragen door C. quinquefasciatus, hebben onderzoekers en vectorcontrolebureaus veelgebruikte instrumenten voor muggenpopulatiecontrole gebruikt, zoals het aanbrengen van insecticiden6, deze methoden zijn echter duur, niet specifiek voor soorten en hebben een beperkte effectiviteit omdat de resistentie tegen insecticiden hoog is in veel C. quinquefasciatuspopulaties 6,7,8,9. Andere controletechnieken, zoals op Wolbachiagebaseerde populatiecontrolestrategieën , zijn de afgelopen jaren ontwikkeld10,11, maar de fitnesskosten in verband met Wolbachia-infectie beperken de haalbaarheid van deze benadering voor deze vector12. Er zijn ook genetische bestrijdingsmethoden ontwikkeld bij andere muggensoorten zoals Aedes aegypti13 , 14, Anopheles gambiae15 en Anopheles stephensi16, inclusief de ontwikkeling van pathogene resistente muggen 17,18,19, die ook kunnen worden ontwikkeld voor C. quinquefasciatus als de vereiste genoomtechniektools zijn ontwikkeld voor deze soort. De biologie van C. quinquefasciatus verschilt echter sterk van andere Aedes- en Anopheles-muggenvectoren, wat de ontwikkeling van vergelijkbare genetische technologieën in deze vector moeilijk heeft gemaakt. Met de komst van crispr-gebaseerde genoom engineering technologieën, precieze genoom engineering is steeds trivialer, betaalbaarder en aanpasbaar geworden en heeft bijgevolg geleid tot de ontwikkeling van nieuwe genetische hulpmiddelen in een breed scala van soorten.
Om mutaties te genereren met CRISPR-gebaseerde technologieën, wordt een mengsel van Cas9-eiwit en synthetische guide RNA (sgRNA), complementair aan de gewenste loci, micro-geïnjecteerd in embryo’s in het pre-blastoderm stadium. Aangezien C. quinquefasciatus vrouwtjes hun eieren leggen in groepen die zijn bevestigd in een drijvende vlotstructuur (Figuur 1), in tegenstelling tot het legen van individuele eieren, een eigenschap van Aedes en Anopheles muggen, worden embryomicro-injections steeds ingewikkelder bij deze soort. Culexlarven komen ook uit de voorste kant van elk ei, dat in contact staat met het wateroppervlak(figuur 1),dus eioriëntatie na manipulatie is belangrijk bij deze soort. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol ontworpen voor de micro-invoeging van Cas9-eiwit en sgRNA in C. quinquefasciatus embryo’s. Dit protocol is ontworpen om eigenschappen te huisvesten die uniek zijn voor de Culex-biologie om de embryooverleving en genoommutatiesnelheden te verbeteren door middel van bepaalde stappen die essentieel zijn voor tijdige eicelverzameling en ei-overleving.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met recente inspanningen om genetisch gemanipuleerde tools voor muggenvectorbestrijding te genereren, is het nodig om embryomicro-injectieprotocollen te ontwikkelen en te optimaliseren voor veelvoorkomende muggenziektevectoren. Hoewel er methoden zijn ontwikkeld voor Aedes- en Anopheles-muggen, is een protocol dat speciaal voor Culex is ontworpen, minimaal onderzocht. Over het algemeen kunnen muggenembryo-injectieprotocollen worden onderverdeeld in 3 algemene stappen: 1) embryoverzameling en -voorbereiding, 2) embryo-injectie en 3) herstel na injectie. Om mutanten succesvol te genereren, moeten alle drie de stappen worden geoptimaliseerd voor de doelsoort. Dit aangepaste protocol voor embryomicro-injection is specifiek voor succesvolle genoomtechniek van Culex-muggen.
Het maximaliseren van embryoverzameling is een veel voorkomend knelpunt in embryomicro-injectieprotocollen. Om het aantal verzamelde eieren in korte tijd te verhogen, werden muggen gedurende 2-3 dagen na het bloedmeel beperkt van een ovipositiesubstraat. Het is belangrijk op te merken dat C. quinquefasciatus de neiging heeft om de voorkeur te geven aan aviaire bloedbronnen in tegenstelling tot zoogdierbronnen of membraanvoeding met zoogdierbloed. Veel onderzoekers hebben echter moeite om een betrouwbare bron van levende vogels of vogelbloed te verkrijgen voor bloedvoeding, zodat laboratoriumbestanden kunnen worden aangepast om zich te voeden met meer toegankelijke bloedbronnen. Het is ook cruciaal om voedingsrijk water te gebruiken voor het ovipositiesubstraat, omdat het ovipositie-aanwijzingen biedt voor C. quinquefasciatus en de meeste andere Culex-vectoren. Er zijn veel methoden om voedselrijk water te genereren, dat mogelijk moet worden geoptimaliseerd tussen laboratoria om ervoor te zorgen dat een geschikt aantal eieren beschikbaar is voor micro-insectie. Hoewel deze methode bijvoorbeeld het meest succesvol was met konijnenuitwerpselen die gedurende 5 of meer dagen in gedeioneerd water werden gefermenteerd, hebben andere onderzoekers meer succes met gras- of visvoer als voedingsbron en sommige zelfs met gedestilleerd water21.
Omdat Culex-muggen groepen eieren in vlotten leggen, is het verzamelen van eieren vrij eenvoudig. Eieren kunnen eenvoudig worden verzameld door het hele vlot met een penseel te scheppen. Eischeiding is ingewikkelder, maar essentieel voor een succesvolle injectie. Eieren kunnen zorgvuldig van het vlot worden gescheiden door zachte neerwaartse druk tussen eieren met penseel of tang toe te passen. Met enige oefening waren meerdere gebruikers betrouwbaar in staat om enkele eieren van eiervlotten te scheiden. Na het scheiden van elk ei worden de eieren in dezelfde richting uitgelijnd op dubbelzijdig plakband, dat de eieren stabiliseert tijdens micro-injection. Eieren worden geïnjecteerd in het taps toelopende achterste uiteinde en de toevoeging van halokoololie houdt de eieren vochtig tijdens manipulatie.
Om embryoschade tijdens micro-injectie te beperken, moeten injectienaalden van de juiste sterkte zijn en onder een geschikte hoek worden afgeschuind. Aluminosilicaatnaalden die 10 seconden onder een hoek van 50° werden afgeschuind, hadden de beste resultaten, maar borosilicaat- en kwartsnaalden kunnen ook werken, ook al zijn ze misschien minder duurzaam en duurder. Bovendien vergemakkelijkt een goede naaldafschuining een betere doorstroming van de Cas9- en sgRNA-mengsels en creëert het een scherper punt voor gemakkelijkere penetratie in het embryo. In veel gevallen is afschuinen ook een efficiënte manier om verstopte naalden snel te repareren in plaats van de tijd en moeite te besteden aan het vervangen van verstopte naalden.
Na injectie moeten de eieren ten minste 5 minuten ongestoord blijven, waarbij de halokoolstofolie onmiddellijk daarna wordt verwijderd door deze voorzichtig weg te borstelen met een schone kwast. Na verwijdering van de halocarbonolie kunnen de geïnjecteerde eieren in water worden geplaatst om uit te komen, wat meestal binnen 3 dagen na injectie gebeurt. Met oefening en voldoende aantallen eieren kan dit protocol consistente somatische en kiembaanmutaties bereiken in C. quinquefasciatus en is veelzijdig genoeg om het gemakkelijk aan te passen aan andere Culex-muggen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door UCSD-opstartfondsen gericht op O.S.A.
Materials
| 9 oz clear plastic pet cup | Karat | C-KC9 | Insect Rearing and Egg Collection |
| Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate |
| Blood | Colorado Serum Company | 31025 | The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection. |
| Bugdorm | Bugdorm | 4F2222 | Insect Rearing Cage |
| Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | Microinjection |
| Compound Microscope | Olympus BX41 | Microinjection, for embryo injection | |
| Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | Microinjection, to be used with beveler |
| DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Microinjection |
| Double-sided Tape | Scotch | B084NVQGXD | Microinjection, embryo alignment |
| Femtojet 4x or 4i programmable microinjector | Eppendorf | Microinjection | |
| Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | Microinjection |
| Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Microinjection, embryo collection |
| Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | Microinjection, embryo alignment |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773 | Microinjection, embryo alignment |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | Microinjection, embryo alignment |
| Hemotek | Hemotek | PS5 | Line Maintenance |
| Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | Microinjection, needle beveling |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | Microinjection, needle pulling |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | Microinjection, embryo alignment |
| Non-Drying Modeling Clay | Jovi | B0025Z71IM | Microinjection, needle storage |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | Microinjection, for embryo alignment |
| Sugar | Domino | 20% sugar solution for adult sugar source. | |
| T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Preparation of microinjection materials |
| TOPO TA Cloning Kit | ThermoFischer Scientific | K451020 | Preparation of microinjection materials |
| Ultra-fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | Microinjection, embryo alignment |
References
- Final Cumulative Maps and Data | West Nile Virus. CDC Available from: https://www.cdc.gov/westnile/statsmaps/cumMapsData.html#eight (2019)
- APHIS | West Nile Virus (WNV). USDA Available from: https://www.aphis.usda.gov/aphis/ourfocus/animalhealth/animal-disease-information/equine/wnv (2020)
- Luke George, T., et al. Persistent impacts of West Nile virus on North American bird populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (46), 14290-14294 (2015).
- van Riper, C., van Riper, S. G., Lee Goff, M., Laird, M. The Epizootiology and Ecological Significance of Malaria in Hawaiian Land Birds. Ecological Monographs. 56 (4), 327-344 (1986).
- Liao, W., Atkinson, C. T., LaPointe, D. A., Samuel, M. D. Mitigating Future Avian Malaria Threats to Hawaiian Forest Birds from Climate Change. PloS One. 12 (1), 0168880 (2017).
- Martins, W. F. S., et al. Transcriptomic analysis of insecticide resistance in the lymphatic filariasis vector Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 9 (1), 11406 (2019).
- Norris, L. C., Norris, D. E. Insecticide resistance in Culex quinquefasciatus mosquitoes after the introduction of insecticide-treated bed nets in Macha, Zambia. Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 36 (2), 411-420 (2011).
- Corbel, V., et al. Multiple insecticide resistance mechanisms in Anopheles gambiae and Culex quinquefasciatus from Benin, West Africa. Acta tropica. 101 (3), 207-216 (2007).
- Yadouléton, A., et al. Insecticide resistance status in Culex quinquefasciatus in Benin. Parasites & Vectors. 8, 17 (2015).
- Atyame, C. M., et al. Wolbachia-based population control strategy targeting Culex quinquefasciatus mosquitoes proves efficient under semi-field conditions. PloS One. 10 (3), 0119288 (2015).
- Atyame, C. M., et al. Cytoplasmic incompatibility as a means of controlling Culex pipiens quinquefasciatus mosquito in the islands of the south-western Indian Ocean. PLoS Neglected Tropical Diseases. 5 (12), 1440 (2011).
- Almeida, F., et al. Effects of Wolbachia on fitness of Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae). Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 11 (8), 2138-2143 (2011).
- Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife. 9, 51701 (2020).
- Phuc, H. K., et al. Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control. BMC Biology. 5, 11 (2007).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Gantz, V. M., et al. Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (49), 6736-6743 (2015).
- Buchman, A., et al. Engineered resistance to Zika virus in transgenic expressing a polycistronic cluster of synthetic small RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3656-3661 (2019).
- Buchman, A., et al. Broad dengue neutralization in mosquitoes expressing an engineered antibody. PLoS Pathogens. 16 (1), 1008103 (2020).
- Isaacs, A. T., et al. Engineered resistance to Plasmodium falciparum development in transgenic Anopheles stephensi. PLoS Pathogens. 7 (4), 1002017 (2011).
- Liu, N., Li, T., Reid, W. R., Yang, T., Zhang, L. Multiple Cytochrome P450 genes: their constitutive overexpression and permethrin induction in insecticide resistant mosquitoes, Culex quinquefasciatus. PloS One. 6 (8), 23403 (2011).
- Kauffman, E., et al. Rearing of Culex spp. and Aedes spp. Mosquitoes. Bio Protocols. 7 (17), 2542 (2017).
- Richards, S. L., Anderson, S. L., Yost, S. A. Effects of blood meal source on the reproduction of Culex pipiens quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 37 (1), 1 (2012).
- Kitzmiller, J. B., Micks, D. W. Techniques for Rearing Culex Mosquitoes. American Midland Naturalist. 52 (1), 253 (1954).
- Mordue, A. J., Blackwell, A., Hansson, B. S., Wadhams, L. J., Pickett, J. A. Behavioural and electrophysiological evaluation of oviposition attractants for Culex quinquefasciatus say (Diptera: Culicidae). Experientia. 48 (11-12), 1109-1111 (1992).
- Allgood, D. W., Yee, D. A. Oviposition preference and offspring performance in container breeding mosquitoes: evaluating the effects of organic compounds and laboratory colonisation. Ecological Entomology. 42 (4), 506-516 (2017).
- Li, M., Bui, M., Akbari, O. S. Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation. Journal of Visualized Experiments. (130), e56990 (2017).
- Li, M., et al. Generation of heritable germline mutations in the jewel wasp Nasonia vitripennis using CRISPR/Cas9. Scientific Reports. 7 (1), 1-7 (2017).
- Li, M., Akbari, O. S., White, B. J. Highly Efficient Site-Specific Mutagenesis in Malaria Mosquitoes Using CRISPR. Genes, Genomes, Genetics. 8 (2), 653-658 (2018).
- Li, M., Bui, M., Yang, T., White, B. J., Akbari, O. S. Germline Cas9 Expression Yields Highly Efficient Genome Engineering in a Major Worldwide Disease Vector, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (49), 10540-10549 (2017).
- Li, M., et al. Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9. Insect Molecular Biology. 29 (2), 214-220 (2020).
- New England Biolabs Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclease I. NEB Available from: https://www.neb.com/protocols/2014/08/11/determining-genome-targeting-efficiency-using-t7-endonuclease-i (2020)
