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Biology

Ein murines Modell einer Verbranntenwunde, rekonstruiert mit einem allogenen Hautgraft

Published: August 08, 2020
doi:
10.3791/61339
, , , ,
1Laboratoire de Physique des Plasmas, École Polytechnique,Sorbonne Université, CNRS, 2Institut de Recherche Biomédicale des Armées, Clamart,INSERM UMRS-MD

Summary

Ziel dieser Studie war es, ein murines Modell der Verbrennungswundung zu entwickeln. Eine thermische Verbrennung wurde auf der rückenden Haut von Mäusen mit einer vorgeheizten Messingschablone induziert. Verbranntes Gewebe wurde entbraut und mit einem Hauttransplantat überzogen, das vom Schwanz einer genetisch ähnlichen Spendermaus geerntet wurde.

Abstract

Triviale oberflächliche Wunden heilen ohne Komplikationen durch primäre Absicht. Tiefe Wunden, wie Volldicke Verbrennungen, heilen durch sekundäre Absicht und erfordern chirurgische Debridement und Hauttransplantation. Die erfolgreiche Integration des Spendertransplantats in ein Wundbett des Empfängers hängt von der rechtzeitigen Rekrutierung von Immunzellen, einer robusten angiogenen Reaktion und einer neuen extrazellulären Matrixbildung ab. Die Entwicklung neuartiger therapeutischer Wirkstoffe, die auf einige Schlüsselprozesse der Wundheilung abzielen, wird durch das Fehlen zuverlässiger präklinischer Modelle mit optimierter objektiver Beurteilung des Wundverschlusses behindert. Hier beschreiben wir ein kostengünstiges und reproduzierbares Modell der experimentellen Volldickenverbrennungswunde, die mit einem allogenen Hauttransplantat rekonstruiert wurde. Die Wunde wird auf der Dorsum-Oberfläche von anästhesierten Inzucht-Wildtypmäusen aus dem BALB/C- und SKH1-Hrhr-Hintergrund induziert. Die Verbrennung erfolgt mit einer Messingschablone mit einem Durchmesser von 10 mm, die auf 80 °C vorgewärmt und bei konstantem Druck für 20 s geliefert wird. Burn eschar wird 24 Stunden nach der Verletzung ausgeschnitten und durch ein volldickes Transplantat ersetzt, das vom Schwanz einer genetisch ähnlichen Spendermaus geerntet wird. Für den Eingriff ist keine spezielle Ausrüstung erforderlich und chirurgische Techniken sind einfach zu befolgen. Die Methode kann mühelos implementiert und in den meisten Forschungsumgebungen reproduziert werden. Dem Modell sind bestimmte Einschränkungen zugeordnet. Aufgrund technischer Schwierigkeiten ist die Ernte von dünneren Split-Dicke-Hauttransplantaten nicht möglich. Die chirurgische Methode, die wir hier beschreiben, ermöglicht die Rekonstruktion von Verbrennungswunden mit volldicken Hauttransplantaten. Es kann verwendet werden, um präklinische therapeutische Tests durchzuführen.

Introduction

Chirurgische Debridement und Hauttransplantation sind häufige klinische Praktiken in der Behandlung von chronischen Wunden verwendet1, Brennen Wunden2, und akute Wunden wie traumatische Wunden3. Die Hauttransplantation bezieht sich auf den chirurgischen Eingriff, bei dem gesunde Haut von einem Teil des Körpers entfernt und auf einen anderen übertragen wird. Spendertransplantate ersetzen das verlorene Gewebe und stellen ein strukturelles Gerüst für zelluläre Migration und Wachstum. Nach der Integration in die Empfängerstelle ersetzen Hauttransplantate die verlorene Hautbarriere, indem sie Schutz vor mikrobiellen Eingriffen, schädlichen Auswirkungen der äußeren Umgebung und übermäßigem Feuchtigkeitsverlust bieten4. Eine erfolgreiche Integration von Hauttransplantaten hängt von mehreren Faktoren ab. Dazu gehören angemessene Immunantworten in Gegenwart von mikrobiellen Infektionen und rechtzeitige Lösung von Entzündungen, robuste Angiogenese an der Wundstelle und die Etablierung von Vaskulären anastomosen zwischen dem Empfängerbett und dem Spendertransplantat5. Wenn das Transplantat zu abbauen beginnt, müssen die ansässigen dermalen Zellen durch Zellen ersetzt werden, die in der Lage sind, eine neue extrazelluläre Matrix zu erzeugen. Gleichzeitig müssen die epidermalen Keratinozyten über die neu produzierte Matrix kriechen, um die Neoepidermis zu bilden und die Wunde neu zu epithelisieren. Es ist daher offensichtlich, dass eine effiziente Migration von Zellen vom Empfängerbett in das Spendertransplantat ein weiterer entscheidender Faktor ist, der die erfolgreiche Transplantat-Integration beeinflusst. Angesichts der Vielzahl von Faktoren, die an der Wundheilung6beteiligt sind, die in den Studien am Menschen aufgrund ethischer Einschränkungen möglicherweise nicht zu kontrollieren sind, sind Modelle der präklinischen experimentellen Hauttransplantation notwendig. Die Entwicklung präklinischer Modelle der Verbrennungswundheilung und der damit verbundenen Hauttransplantation wird für das Verständnis komplexer Mechanismen bei der Reparatur von Hautgewebe wichtig und für die Erprobung neuer therapeutischer Wirkstoffe unerlässlich sein. Die In-vitro-Modelle der Wundheilung sind nicht in der Lage, die Komplexität des Hautgewebes genau nachzuahmen. Die in vivo Tiermodelle sind ein unverzichtbares Untersuchungsinstrument, um die Mechanismen der Gewebereparatur zu verstehen.

Mehrere Methoden der Hauttransplantationstechnik wurden bei Nagetieren entwickelt, um chirurgische Exzision nachzuahmen und die Rekonstruktion von Verbrennungswunden7,8,9. Die meisten der zuvor beschriebenen Verfahren konnten jedoch vor der Hauttransplantation keine thermische Verbrennungsverletzung auslösen. Anstelle der Brandwunde wurde eine volldicke Exzisionswunde induziert, die dann mit einer dicken Hautallograft7rekonstruiert wurde. Verschiedene anatomische Sehenswürdigkeiten wie Ohr, Schwanz und Rücken wurden für die Ernte der Spenderhaut bei Nagetieren7,8verwendet. Verschiedene Transplantatfixierungs- und Stabilisierungstechniken wurden berichtet, einschließlich einer “No-Nture-Technik”9, Nähte7 und chirurgischer Kleber10,11,12.

Der Zweck dieser Studie war es, ein murines Modell einer Volldicke Zufallswunde zu entwickeln, die den aktuellen Goldstandard-Ansatz in der Verbrennungsbehandlung rekapitulieren würde, der nicht lebensfähige Gewebeexzision und Hauttransplantation beinhaltet. Eine thermische Verbrennung wurde auf der Dorsum-Oberfläche einer Maus mit einer vorgeheizten Messingschablone induziert. Burn Eschar wurde ausgeschnitten und durch ein Volldicketransplantat ersetzt, das vom Schwanz einer Spendermaus geerntet wurde. Dieses experimentelle Modell hat drei wesentliche Vorteile. Erstens kann mehr als eine Brandwunde auf der Rückseite der Empfängermaus induziert werden, und vier Spenderhauttransplantate können von einem einzigen Schwanz der Spendermaus geerntet werden. Dies bedeutet, dass mehrere experimentelle und Kontrollbehandlungen möglicherweise mit demselben Empfänger und Spendertieren verglichen werden können. Je nach gewünschtem Verabreichungsweg kann die Kontrollbehandlung die lokale oder systemische Verabreichung des Fahrzeugs oder placebo-Kontrolle umfassen (z. B. topische Anwendung von Salbe, subkutane, intraperitoneale oder intravenöse Injektion der Lösung). Zweitens kann der Zeitpunkt der Behandlung und der Endpunkt des Experiments kontrolliert werden. Drittens hängt dieses Modell von der Rekonstruktion von Wunden mit Volldickentransplantaten ab, die vom Schwanz geerntet werden, die bekanntermaßen eine höhere Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche Aufnahme in die Spenderstelle haben als die Haut, die von der Rückseite geerntet wird13. Dies kann auf die geringere Anzahl von epidermalen Langerhans-Zellen zurückzuführen sein, die eine Schlüsselrolle in der kutanen Immunbiologie spielen und mit der Hauttransplantat-Abstoßung14assoziiert sind.

Das vorgeschlagene Modell der Wundheilung und Transplantatintegration kann durchaus auf transgene und Knockout-Mäuse angewendet werden. Die Verwendung von genetisch veränderten Mäusen wird helfen, die Rolle zu klären, die bestimmte Gene bei der Wundreparatur spielen können. Die exogene Anwendung topischer Wundpräparate oder die subkutane Verabreichung von therapeutischen Antikörpern an der Stelle der Schädigung kann ebenfalls in Betracht gezogen werden.

Aufgrund technischer Schwierigkeiten sind gespaltene Hauttransplantate, die aus der Epidermis und einem Teil der Dermis bestehen, bei Mäusen schwer zu erhalten. Es ist bekannt, dass Hauttransplantate mit voller Dicke, bestehend aus der Epidermis und der Volldickendermis, ein gut vaskularisiertes Wundbett für eine erfolgreiche Integration benötigen. Die Unfähigkeit, gespaltene Dicke Hauttransplantate bei Mäusen zu ernten, kann als Einschränkung dieses Modells angesehen werden. Die Fixierung des Hauttransplantats am Empfänger-Wundbett wurde durch die Anwendung des chirurgischen Klebeklebers erreicht, der mit weniger Trauma und schnellerem Abbau im Vergleich zu anderen Mitteln der Gewebefixierung15verbunden ist. Frühere Studien haben gezeigt, dass Naht ist mit stärkeren Gewebefixierung als der chirurgische Kleber bei 24 h nach dem chirurgischen Eingriff15verbunden, die als Nachteil des Verfahrens betrachtet werden kann. Zu späteren Zeitpunkten wird die biomechanische Stärke der mit einem chirurgischen Klebstoff behandelten Wunden jedoch mit den Nähten15 und besser vergleichbar als die Heftfixierung16. Nach der Gewebefixierung mit dem chirurgischen Kleber müssen die Wunden mit einem Wundverband bedeckt sein. Obwohl Wunden auf der Rückenoberfläche der Maus für das Tier schwer zu erreichen sind, ist der Wundverband für das Tier leicht zu manipulieren und zu entfernen. Häufige Wechsel des Wundverbandes können gerechtfertigt sein.

Anästhesie-induzierte Hypothermie bei kleinen Nagetieren ist ein gut dokumentiertes Phänomen17. Hypothermie ist eine Nebenwirkung dieses Verfahrens, das Komplikationen verursacht und potenziell sowohl die Tiergesundheit als auch die Datenqualität beeinträchtigt. Daher rechtfertigt diese Methode die Umsetzung von Temperaturmanagementstrategien, insbesondere wenn haarlose SKH1-Hrhr eingesetzt werden.

Die bedeutendste Einschränkung der Verwendung von Mäusen zur Nachahmung des menschlichen Wundverschlusses ist der Unterschied zwischen der Hautanatomie und physiologie. Mauswunden heilen meist durch Kontraktion, während menschliche Wunden durch Granulationsgewebebildung und Reepithelierung heilen18. Um diese Diskrepanz zu berücksichtigen, kann das aktuelle Modell modifiziert und in Kombination mit einem Splitterring verwendet werden, der fest um die Wunde befestigt ist, um eine Hautkontraktion zu verhindern19. Angesichts einiger Vor- und Nachteile dieses In-vivo-Protokolls könnte dieses Modell als Werkzeug dienen, um bestimmte Prozesse zu untersuchen, die an der Wundheilung beteiligt sind und in vitro nicht zu studieren sind.

Protocol

Alle Experimente wurden vom französischen Ministerium für Hochschulbildung und Forschung genehmigt (Studiennummer: 122162017111616517670v2 und DAP180012). Alle Mäuse wurden bei der Ankunft in Plastikkäfigen ein-Haus gebaut und durften vor der Studie eine 7-tägige Akklimatisierungszeit. Der Tierraum wurde in einem 12/12 h Licht/Dunkel-Zyklus (Licht ein, 07:00 Uhr) gepflegt. Nahrungsmittel und Leitungswasser wurden ad libitum zur Verfügung gestellt. BALB/c- und SKH1-Hr-Mäuse wurden mit traditioneller Weizen-/Soja-Diät gefüttert. Sägemehl-Bettwäsche wurde zusammen mit Nistmaterial zur Verfügung gestellt. 1. Gerätevorbereitung Bereiten Sie ein Brenngerät für den Vorgang vor und stellen Sie es mit dem Temperaturregler auf 80 °C ein(Abbildung 1A). Überprüfen Sie die Temperatur der Messingschablone (Abbildung 1B,C) mit der Infrarot-Wärmebildkamera. Stellen Sie sicher, dass das digitale Manometer ordnungsgemäß funktioniert. Bedecken Sie die Bühne mit einem chirurgischen Vorhang und passen Sie die Höhe des Tisches an (Abbildung 1A). 2. Präoperative und intraoperative Tierpflege Erwerben Sie BALB/c- und SKH1-Hrhr-Mäuse im Alter von 6-8 Wochen. Fügen Sie Paracetamol Suspension bei 3 mg/ml in Trinkwasser und Versorgung 12 Stunden vor und bis zu 72 Stunden nach dem Eingriff. Mit einer 1 ml Spritze und einer 26 G-Nadel buprenorphin subkutan in 0,05 g/g 30 min vor dem Eingriff und alle 6 Stunden für die ersten 72 Stunden nach dem Eingriff verabreichen. Mit einer 1 ml Spritze und einer 26 G Nadel Lidocain auf das Dorsum der Maus und 2-3 mm distal auf den Bereich der Brandwunde verabreichen. Injizieren Sie Lidocain mit 0,05 g/g subkutan 15 min vor der Induktion der Verbrennungswunde. Anästhesisieren Sie Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Xylazin bei 10 mg/kg und Ketamin 100 mg/kg. Verwenden Sie eine 1 ml Spritze und eine 26 G Nadel, um die Injektion zu verabreichen. Kritischer Schritt: Legen Sie die anästhesierte Maus auf ein beheiztes Pad und halten Sie die Maus warm, um Hypothermie für die ersten 30 Minuten nach der Induktion der Anästhesie und für mindestens 15 Minuten nach der Genesung von der Anästhesie zu verhindern. Zusätzlich zum beheizten Pad können andere Modalitäten wie Wärmelampen,zirkulierende warme Flüssigkeiten oder Luft und vorgewärmte Wärmespeicher verwendet werden, um die Körpertemperatur zu regulieren. Schmiergel auf die Augen der Maus auftragen, um eine Austrocknung der Hornhaut zu verhindern. Verwenden Sie den Zehenpinch-Entzugsreflex, um die Tiefe der Anästhesie zu beurteilen. Mit einer 1 ml Spritze und einer 26 G Nadel verabreichen 200 l Laktatringlösung, ergänzt mit 5% Dextrose. Den Flüssigkeitsersatz unmittelbar nach der Induktion der Anästhesie und 6 Stunden nach dem Eingriff subkutan verabreichen, um Eine Dehydrierung zu verhindern. 3. Volle Dicke Brennen Wunde Induktion Rasieren Sie die anästhesierte Maus mit den Haarschneidern. Enthaarungscreme 1 Minute auf die Dorsum-Oberfläche der Maus auftragen. Wischen Sie die Creme mit etwas steriler Gaze ab und reinigen Sie den Bereich mit einem Stück feuchter Gaze. Die Haut mit etwas Gaze bis zum Trocknen abblasen. Legen Sie die Maus auf die Bühne mit einem chirurgischen Vorhang bedeckt und bewegen Sie die Bühne nach oben an die vorgeheizte Messingschablone. Tragen Sie die kreisförmige Messingschablone auf die Rückseite der Maus (80 °C für 20 s) mit konstantem Druck von 0,15 N (Abbildung 2). Kritischer Schritt: Unmittelbar nach der Verbrennungsinduktion das anbeängisierte Tier auf das beheizte Pad legen, um Unterkühlung zu verhindern und die Maus während und nach dem Eingriff warm zu halten. Sobald Sie sich von der Anästhesie erholt haben, kehren Sie die Maus zurück in den Käfig. Kritischer Schritt: Geben Sie eine pürierte Diät auf dem Käfigboden für die ersten 72 Stunden nach dem chirurgischen Eingriff. Mäuse sind manchmal zögerlich, bis zu einem Sipper Rohr zu greifen, um Wasser nach einer Verbrennungswunde Zutrinken. 4. Ernte des Spendertransplantats Machen Sie einen Längsschnitt mit einem Skalpell im oberen Teil des Schwanzes der Spendermaus und entfernen Sie die Haut vorsichtig mit chirurgischen Zangen. Legen Sie die Schwanzhaut in eine sterile Petrischale, gefüllt mit 10 ml steriler 0,9% Salinelösung. Verwenden Sie ein Lineal, um einzelne Transplantate zu messen und schneiden Sie die Schwanzhaut in Stücke, die jeweils 15 mm messen, mit einem Skalpell. Nach der Präparat die Hauttransplantate bis zu 2 Stunden in 0,9%iger Salinelösung bei 4 °C aufbewahren. 5. Chirurgische Exzision und Hauttransplantation 24 Stunden nach der Verbrennungsinduktion bereiten Sie die Maus auf die Anästhesie durch Einatmen von Isofluran vor. Legen Sie die Maus in die Induktionskammer und induzieren Sie Anästhesie mit 5% Isofluran in 100% Sauerstoff bei einer Durchflussrate von 4 L/min. Um die Anästhesie während der Operation aufrechtzuerhalten, verwenden Sie 2% Isofluran bei 2 L/min. Legen Sie einen chirurgischen Vorhang auf die Maus und schneiden Sie ein Fenster aus, um das chirurgische Feld freizulegen. Mit der aseptischen Technik, wischen Sie die Wunde zuerst mit Povidon-Jod und dann mit 70% Alkohol. Nehmen Sie das verbrannte Gewebe vorsichtig mit einer chirurgischen Pinzette auf und verbrauchen Sie alle nekrotischen und nicht lebensfähigen Gewebe mit steriler chirurgischer Schere und Pinzette. Entfernen Sie die Panniculus-Carnosusschicht der Hypodermis, um ein stabiles Empfängerbett zu schaffen. Legen Sie das Hauttransplantat auf das frisch zubereitete Wundbett. Ziehen Sie die umgebende Haut vorsichtig mit einer chirurgischen Pinzette in Richtung Hauttransplantat. Tragen Sie einen chirurgischen Klebstoff auf, um das Transplantat am Wundbett zu befestigen, und drücken Sie vorsichtig, um die Hautränder auszurichten. Kritischer Schritt: Die Größe des Wundbettes muss leicht größer als die Größe des Hauttransplantats sein, um eine erfolgreiche Transplantation zu gewährleisten. Lassen Sie die Maus von der Anästhesie erholen. Kritischer Schritt: Legen Sie die Maus auf ein beheiztes Pad. Halten Sie die Maus während und nach dem Eingriff warm, um Unterkühlung zu verhindern. Tragen Sie inert Paraffin Gaze Dressing und Klebstoff Sekundärdressing über die gepfropfte Wunde. Legen Sie die Maus in einen einzelnen Käfig. Kritischer Schritt: Geben Sie einige pürierte Diät auf dem Käfigboden für die ersten 72 Stunden nach dem chirurgischen Eingriff und überwachen Sie täglich. Bieten Sie Spielzeug und bereichern Sie die Umwelt. 6. Digitale Bildgebung und post-mortem Wundsammlung Fotografieren Sie Wunden mit einer Digitalkamera, indem Sie ein Lineal neben die Wunde stellen (Abbildung 3). Am Ende des Experiments, einschläfern Tiere durch Exposition gegenüber Kohlendioxid und Zervixdislokation. Kritischer Schritt: Übermäßige Zugwirkung der Haut während der Zervixdislokation kann das Transplantat beschädigen. Bei der Obduktion werden die dorsalen Brandwunden mit einer Schere chirurgisch an die Faszien geschnitten. Bisect Wunden. Fix Die Hälfte in 10% gepuffertem Formalin und Prozess für Histologie und Immunhistochemie. Die andere Hälfte in flüssigem Stickstoff für die RNA-Extraktion und Proteinquantifizierung schnell einfrieren und bei -80 °C halten. 7. Hauthistologie, Immunhistochemie und Kollagenvisualisierung Hautproben in Paraffin einbetten, auf 4 m abschnitte schneiden und auf positiv geladene Dias legen. Verwenden Sie mit Hämatoxylin und Eosin gefärbte Dias, um die Rate der Reepithelisierung (% der ursprünglichen Wunde) zu bewerten. Der mit Neoepidermis bedeckte Bereich der Wunde kann als Prozentsatz der gesamten Wunde ausgedrückt werden (Abbildung 4). Verwenden Sie eine digitale Mikroskopanwendung und ImageJ-Software, um die mikroskopische Analyse der Abschnitte durchzuführen. Verwenden Sie histologische Abschnitte (4 m Dicke), die aus formalinfixiertem und paraffinintegriertem Gewebe hergestellt werden, und unterwerfen Sie sie der Immunhistochemie. Zur Beurteilung der Kollagen-I- und Fibronectin-Expression in Wunden, wenden Sie primäre Antikörper an und brüten 1 h. Der Nachweis kann durch artspezifische Meerrettichperoxidase (HRP) oder alkalische Phosphatase (AP)-konjugierte sekundäre Antikörper durchgeführt werden. Reagieren Sie Abschnitte mit: (i) HRP,3,3′-Diaminobenzidin (DAB) oder (ii) AP, Bond Polymer Refine Red (Table of Materials), was eine leuchtend rote Farbe ergibt (Abbildung 5). Scannen Sie die Abschnitte mit einem Instrument und analysieren Sie mit der digitalen Mikroskopanwendung und ImageJ. Um eine histologische Beurteilung der Kollagenablagerung zu ermöglichen, führen Sie trichrome Färbungen an histologischen Abschnitten mit einem kommerziellen Kit durch. Für die Visualisierung von Kollagenfasern verwenden Sie Die Multiphotonenmikroskopie und die zweite technik der harmonischen Erzeugung (Abbildung 5). Verwenden Sie ein Multiphotonenmikroskop für die Gewebebildgebung, wie zuvor beschrieben20. Verwenden Sie einen Ti:Sapphire-Laser mit einer mittleren Wellenlänge von 810 nm als Laserquelle zur Erzeugung von zweiten harmonischen und zweiphotonenangeren Fluoreszenzsignalen (TPEF). Verwenden Sie einen Laserstrahl, der mit einem 25x/0,95 W Objektiv ausgestattet ist, um die zweite harmonische Generation (SHG) und TPEF zu sammeln und zu begeistern. Erkennen Sie Signale, wie zuvor21 von NDD PMT-Detektoren beschrieben. Verwenden Sie Software zur Laserscansteuerung und Bildaufnahme.

Representative Results

Die Ergebnisse zeigen, dass das entwickelte Protokoll eine einfache Methode ist, die die Induktion einer Volldicke bei Mäusen ermöglicht. Verbrennungen werden mit einer vorgeheizten Messingschablone induziert (Abbildung 1A-C). Der verbrannte Bereich erscheint als kreisförmige Wunde mit einer weißen Eschar und einer hyperämischen Zone. Die Größe der Verbrennungswunde ist etwas größer bei 24 Stunden nach der Verbrennungsverletzung als Folge des gut beschriebenen Phänomens bekannt als die Verbrennung Verletzung Progression, die möglicherweise aufgrund einer akuten Entzündung22. Nach der Exzision werden Die Brandwunden mit allogenen Hauttransplantaten rekonstruiert (Abbildung 3). Am Tag 7 nach der Verbrennungsverletzung werden Wunden vaskularisiert5, was ein Hinweis auf eine erfolgreiche Transplantation ist. Epidermale Keratinozyten wandern von der angrenzenden Empfängerhaut, um die Wunde zu schließen und die Lücke zwischen den beiden Rändern der Wunden zu überbrücken. Die mikroskopische Analyse von H- und E-gefärbten Wunden ergab, dass die Länge der Neoepidermis am 7. Tag nach einer Brandverletzung im Vergleich zu Tag 3 nach einer Brandverletzung deutlich länger wird(Abbildung 4B). Vor der Durchführung einer großen Studie wird den Forschern dringend empfohlen, eine Pilotstudie durchzuführen, die die Erforschung einer neuartigen Intervention, die Bewertung der Durchführbarkeit und die Identifizierung von Änderungen der Methode ermöglicht, um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Statistisch signifikante Effekte sind in kleineren Stichproben schwer zu erkennen, während die Erhöhung der Stichprobengröße eine Möglichkeit ist, die statistische Leistungsfähigkeit eines Tests zu steigern. Um beispielsweise einen statistisch signifikanten Unterschied (p < 0,05) in der Rate der Wundreepithelisierung (Abbildung 4) zwischen Den fraktionen, zu erkennen, sollte der Stichprobenumfang zwischen sechs und acht Mäusen pro Gruppe liegen. Alle Experimente sollten mindestens zweimal wiederholt werden. Da Matrix produzierende Zellen, wie Z. B. Fibroblasten, aus dem Empfängergewebe in das Transplantat wandern, werden Schlüsselkomponenten der extrazellulären Matrix, einschließlich Kollagen I und Fibronectin, in der neu gebildeten Matrix stark exprimiert (Abbildung 5). Abbildung 1: Einrichtung des Brenngeräts. (A) Platzierung und Einrichtung des Brenngeräts. Das Brenngerät ist an den Temperaturregler angeschlossen und an das digitale Monometer angeschlossen, um die Drucküberwachung zu ermöglichen. Das Brenngerät wird über einer verstellbaren Bühne aufgehängt – flache Oberfläche, auf der Mäuse zur Induktion von Verbrennungen platziert werden. (B-C) Ein Nahaufnahmebild der Messingschablone, mit der Wundverbrennungen induziert wurden. (C) Der Durchmesser der Messingschablone beträgt 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Schematische Darstellung der verschiedenen Schritte, die zum Reproduzieren des in diesem Artikel beschriebenen versuchsmodells erforderlich sind. Es gibt drei Hauptschritte zum Verfahren: (i) Induktion der Brandwunde mit einer vorgeheizten Messingschablone; ii) chirurgische Exzision des nicht lebensfähigen nekrotischen Gewebes 24 Stunden nach der Verbrennungsverletzung; iii) chirurgische Wundrekonstruktion mit einem allogenen Hauttransplantat mit voller Dicke, das von einer Spendermaus geerntet wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Die makroskopische Ansicht rekonstruierter Mausverbrennungswunden. Repräsentative digitale Bilder von Brandwunden, die mit allogenen Hauttransplantaten an den Tagen 0, 1, 3 und 7 nach Verbrennungsverletzungen rekonstruiert wurden. Das Lineal auf Bildern ist in Millimetern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Mikroskopisches Auftreten von Wunden bei 3 und 7 Tagen nach der Verbrennungsverletzung. H&E-befleckte Abschnitte von Wunden 3 und 7 Tage nach der Verbrennung Verletzung. Die Länge der Neo-Epidermis (gepunktete Linie) ist signifikant erhöht in (A) Tag 3 Wunden im Vergleich zu (B) Tag 7 Wunden. In (A) und (B) ist die Skala bar 100 m. (C) Grafische Darstellung des Prozentsatzes der Wundreepithelisierung. Dies wurde bewertet, indem die Länge der Neoepidermis an Tag 3 und 7 nach der Verbrennung samt Verletzung gemessen und als Prozentsatz der gesamten Wundlänge ausgedrückt wurde. Die Ergebnisse sind Mittelwert s.E.M. (n = 6 Mäuse in Tag 3 Gruppe; n = 6 Mäuse in Tag 7 Gruppe, *p < 0,05; Schüler-T-Test). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Bewertung der extrazellulären Matrix und Kollagen-I-Visualisierung. Repräsentative Bilder der immunhistochemischen Analyse am Tag 7 Mauswunden für (A) Kollagen und (B) Fibronectin gefärbt. Beachten Sie intensive rote Färbung in längs spindelförmigen Kollagen-I-positiven Zellen. Beachten Sie braune Färbung in Fibronectin-positiven Zellen in der Dermis von Tag 7 Wunden. Skalenbalken = 50 m in allen Bildern. In (A) und (B) bezeichnet e Epidermis und d bezeichnet Dermis. (C) Visualisierung von Kollagenfasern und histologische Beurteilung der Kollagenablagerung. (D) Vertreter TPEF/SHG Kollagenbild von Tag 7 Mauswunden. Die gleichzeitige TPEF/SHG-Erfassung mittels zirkulärer Polarisation und SHG-Signalen wurde selektiv verarbeitet, um nach Anwendung eines Schwellenwerts eine binäre Verteilung von SHG zu erhalten. TPEF-Bilder (grün) und SHG-Bilder (weiß) waren pseudofarben und überlagert. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Nach der Dickenklassifikation der Verbrennungsverletzung23sind Verbrennungen mit voller Dicke durch eine offensichtliche Beteiligung der gesamten Dicke der Haut und eines bestimmten Teils des Unterhautgewebes gekennzeichnet. Diese Art von Wunde kann nur durch Kontraktion oder mit Hauttransplantation2heilen. Eine inhärente Einschränkung der in diesem Artikel beschriebenen Methode ist, dass nur Volldicke Transplantate, im Gegensatz zu den geteilten Dicke Transplantate, die oft in der klinischen Umgebung verwendet werden, wurden aus dem Schwanz einer Maus geerntet. Dies war aufgrund der technischen Schwierigkeiten, da die Maushaut zu dünn ist, um Split-Dicke-Transplantate zu erhalten. Es muss darauf hingewiesen werden, dass Volldicke Transplantate ein gut vaskularisiertes Wundbett erfordern, während gespaltene Dicke Hauttransplantate in der Lage sind, an Spenderstellen mit weniger Vaskularität zu überleben24. Frühere Studien zeigten, dass eine auf der Rückseite der Maus induzierte Verbrennungswunde mit einer robusten Bildung neuer Vaskulatur5verbunden war. Dies deutet darauf hin, dass ein gut vaskularisierter Bereich, wie das Dorsum der Maus, als anatomisches Wahrzeichen für die Induktion von Brandwunden betrachtet werden könnte.

Die Tiefenschärfe der Verbrennung ist ein wichtiger Faktor, den es zu berücksichtigen gilt. Die Tiefe der Verbrennungswunde muss zwischen einzelnen Mäusen konsistent sein. Die Reproduzierbarkeit der Verbrennungstiefe hängt von der Temperatur der Messingschablone, dem Druck und der Dauer der Wärmeeinwirkung ab. Die Verbrennungstiefe muss histologisch überprüft werden. Es ist wichtig zu bedenken, dass übermäßiger Druck oder längere Exposition der Haut gegenüber der vorgeheizten Messingschablone das darunter liegende Gewebe verletzen kann. Das Gewebe, das die Wirbelsäule umgibt, einschließlich der Komponenten des zentralen und peripheren Nervensystems, ist hitzeempfindlich und kann bei Beschädigung zu einer Lähmung des Hinterbeins führen.

Obwohl keine postoperative Mortalität direkt mit dem chirurgischen Eingriff in Verbindung gebracht wurde, entwickelte eine kleine Anzahl von haarlosen SKH1-Hrhr-Mäusen, die besonders kälteempfindlich sind, Eine Unterkühlung und konnte sich nach der Vollnarkose nicht erholen. Daher muss bei allen ästhetischen Ereignissen zusätzliche Wärme vorhanden sein und eine ständige Überwachung ist erforderlich, während die Maus betäubt wird.

Die in dieser Studie beschriebene Methode war nicht mit der Infektion der chirurgischen Stelle verbunden. Allerdings muss aseptische Technik verwendet werden, um die Übertragung von Mikroorganismen in die chirurgische Wunde während der perioperativen Periode zu verhindern. Die Inokulation der Wunde mit biolumineszierenden oder fluoreszierenden Mikroorganismen kann in das Verfahren eingearbeitet werden. Diese Technik kann bei der Untersuchung von infektiösen Organismen und ihrer Pathogenese25nützlich sein. Zum Beispiel kann die exogene Zugabe oder Injektion von biolumineszierenden Bakterien die Überwachung der mikrobiellen Belastung mit Hilfe der in vivo-Gesamtentierbildgebung25ermöglichen. Da Maushaar bekanntermaßen die in vivo ganze Tierfluoreszenz- und Biolumineszenzbildgebung stört, sind haarlose SKH1-Hr-Mäuse ideale Gastgeber für die Studien mit fluoreszierenden oder biolumineszierenden Reportern.

Wundgewebeproben können zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen und für histologische und immunhistochemische Analysen verarbeitet werden. Protein und RNA können aus der Hautbiopsie isoliert werden und molekularbiologische Techniken können verwendet werden, um die Expression von Schlüsselmolekülen zu bewerten, die an der Wundheilung beteiligt sind.

In der vorliegenden Studie beschrieben wir ein experimentelles Modell der Verbrennungswundheilung und allogenen Hauttransplantation. Dieses Verfahren kann modifiziert werden und dient als Modell für präklinische Studien.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt von La Direction Générale de L’Armement, l’Agence de l’Innovation de Défense und école Polytechnique. Wir danken unserem Kollegen Yann Plantier von der École Polytechnique, der Einblicke und Fachwissen zur Verfügung gestellt hat, die die Produktion der Videodatei stark unterstützt haben. Die Autoren danken Herrn Benoit Peuteman und Frau Charlotte Auriau von INSERM Lavoisier (SEIVIL) US 33, Hépital Paul Brousse, Villejuif für ihr tierisches Wohlbefinden und ihre Pflegekompetenz, die sie im Rahmen dieses Projekts zur Verfügung gestellt haben.

Materials

1 ml syringue Terumo SS + 01T1
26 G needle Terumo Agani NN-2613R 1/2'' – 0,45 X 12mm
96X21 mm Petri Dish Dutscher 193199
Animal Weighing scale Kern EMB 5.2K5
BALB/c mouse Janvier labs BALB/cAnNRj 6-weeks old
Biopsy foam pads 30.2X25.4X2mm Simport M476-1
Bond polymer Refine Red Leica Biosystems DS9390
Brass block BVG custom-designed Circular 10 mm in diameter
Buprenorphine (BUPRECARE) Axience FR/V/6328396 3/2011 administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g
Burning apparatus Kausistar 400 TraçaMatrix 34010
CaseViewer 3DHISTECH Ltd. 3Dhistech, Budapest, Hungary
Collagen I antibody Abcam ab34710 Recommanded concentration 1:50; 1:200
D-(+)- glucose (Dextrose) Sigma Aldrich G-8769-100 ml
DAB Leica Biosystems AR9432
Digital camera NIKON D3400 objective: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45
Depilating cream Veet
Disposable scalpels Swann Morton 6601
DPBS PAN biotech P04-36300
Ethanol absolute VWR chemicals 20821.310
Fibronectin antibody Abcam ab23750 Recommanded dilution 1:1000
Filter 0.22um Sartorius 16532
Fine Scissors F.S.T. 14094-11
Forceps Dumont F.S.T. 11295-10
Hair clippers AESCULAP B00VAQ4KUY (ISIS)
Heating pad Petelevage 120070
Isofluorane Piramal healthcare FR/V/03248850/2011
Ketamine Imalgene FR/V/0167433 4/1992 surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 100mg/kg
Lactated Ringers solution Flee-Flex 1506443
Lamina multilabel slide scanner Perkin Elmer
LAS software Leica version 2.7.3
Leica Bond III Leica Biosystem 1757
Leukosilk dressing BSN medical 72669-01
Lidocaine Aguettant N01BB02 local analgesic, administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g
Manometer Kern HDB-5K5
Masson Trichrome Staining kit Sigma-Aldrich HT15-1KT
Micromesh Biopsy cassettes Simport M507
Multiphoton inverted stand Leica SP5 microscope Leica microsystems DM500 Scanner 8000Hz NDD PMT detectors
Non adhering dressing Adaptic Systagenix A6222 12.7cm X 22.9 cm
Ocrygel Tvm France ###
Paracetamol 300mg Dolliprane Liquiz
Paraformaldheyde 4% VWR chemicals 1169945
Povidone-iodine MEDA pharma D08AG02 diluted to 1:2
SKH1-Hrhr mouse Charles river 686SKH1-HR 6-weeks old
Slides Thermoscientific AGAA000080
Surgical adhesive BSN medical 9927
Sterile Gauze Hartmann 418545/9 10 X 10 cm
Sterile water Versylene Fresenius B230521
Surgical drape Hartmann 2775161
Ti:Sapphire ChameleonUltra Coherent DS 16-02-16 F 690-1040 nm
Thermal imaging Camera Testo Testo 868
Xylazine (Rompum 2%) Bayer FR/V/ 8146715 2/1980 surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg
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Blaise, O., Duchesne, C., Banzet, S., Rousseau, A., Frescaline, N. A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft. J. Vis. Exp. (162), e61339, doi:10.3791/61339 (2020).
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