JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Een Murine Model van een burn wound gereconstrueerd met een allogene huidtransplantatie

Published: August 08, 2020
doi:
10.3791/61339
, , , ,
1Laboratoire de Physique des Plasmas, École Polytechnique,Sorbonne Université, CNRS, 2Institut de Recherche Biomédicale des Armées, Clamart,INSERM UMRS-MD

Summary

Het doel van deze studie was om een murine model van burn wound healing te ontwikkelen. Een thermische brandwond werd veroorzaakt op de rughuid van muizen met behulp van een voorverwarmde messing sjabloon. Verbrand weefsel werd gedebrideerd en bedekt met een huidtransplantatie geoogst uit de staart van een genetisch vergelijkbare donormuis.

Abstract

Triviale oppervlakkige wonden genezen zonder complicaties door primaire intentie. Diepe wonden, zoals volledige dikte brandwonden, genezen door secundaire intentie en vereisen chirurgische debridement en huidtransplantatie. Succesvolle integratie van het donorgraft in een wondbed van de ontvanger hangt af van tijdige rekrutering van immuuncellen, robuuste angiogene respons en nieuwe extracellulaire matrixvorming. De ontwikkeling van nieuwe therapeutische middelen, die gericht zijn op een aantal belangrijke processen die betrokken zijn bij wondgenezing, worden belemmerd door het ontbreken van betrouwbare preklinische modellen met een geoptimaliseerde objectieve beoordeling van wondsluiting. Hier beschrijven we een goedkoop en reproduceerbaar model van experimentele volledige dikte burn wond gereconstrueerd met een allogene huidtransplantatie. De wond wordt geïnduceerd op het dorsumoppervlak van verdoofde inteeltwilde typemuizen uit de BALB/C- en SKH1-Hrhr-achtergronden. De brandwond wordt geproduceerd met behulp van een koperen sjabloon met een diameter van 10 mm, dat wordt voorverwarmd tot 80 °C en geleverd onder een constante druk voor 20 s. Brand eschar wordt 24 uur na de verwonding verwijderd en vervangen door een volledige diktetransplantat geoogst uit de staart van een genetisch vergelijkbare donormuis. Er is geen gespecialiseerde apparatuur nodig voor de procedure en chirurgische technieken zijn eenvoudig te volgen. De methode kan moeiteloos worden geïmplementeerd en gereproduceerd in de meeste onderzoeksinstellingen. Bepaalde beperkingen zijn gekoppeld aan het model. Door technische problemen is de oogst van dunnere gespleten dikte huidtransplantaties niet mogelijk. De chirurgische methode die we hier beschrijven zorgt voor de reconstructie van brandwonden met behulp van volledige dikte huidtransplantaties. Het kan worden gebruikt om preklinische therapeutische tests uit te voeren.

Introduction

Chirurgische debridement en huidtransplantatie zijn gangbare klinische praktijken die worden gebruikt bij het beheer van chronische wonden1, brandwonden2, en acute wonden zoals traumatische wonden3. Huidtransplantatie verwijst naar de chirurgische ingreep, waarbij de gezonde huid uit het ene deel van het lichaam wordt verwijderd en naar het andere wordt overgebracht. Donortransplantaties vervangen het verloren weefsel en bieden een structureel schavot voor cellulaire migratie en groei. Na integratie in de ontvangende site vervangen huidtransplantaten de verloren huidbarrière door bescherming tegen microbiële invasie, schadelijke effecten van de externe omgeving en overmatig vochtverlies4. Succesvolle huidtransplantatie integratie is afhankelijk van verschillende factoren. Deze omvatten adequate immuunresponsen in aanwezigheid van microbiële infecties en tijdige oplossing van ontsteking, robuuste angiogenese op de wondplaats en vestiging van vasculaire anastomoses tussen het ontvangende bed en de donortransplantaat5. Als het transplantaat begint te degraderen, moeten ingezeten huidcellen worden vervangen door cellen die nieuwe extracellulaire matrix kunnen produceren. Tegelijkertijd moeten de opperhuidkeratinocyten over de nieuw geproduceerde matrix kruipen om de neo-opperhuid te vormen en de wond opnieuw te epitheeliseren. Het is dus duidelijk dat efficiënte migratie van cellen van het ontvangende bed naar het donorgraft een andere bepalende factor is die een succesvolle integratie van ent beïnvloedt. Gezien het grote aantal factoren die betrokken zijn bij wondgenezing6, die onmogelijk te controleren zijn in de menselijke proeven als gevolg van ethische beperkingen, zijn modellen van preklinische experimentele huidtransplantatie noodzakelijk. Ontwikkeling van preklinische modellen van burn wound healing en bijbehorende huidtransplantatie zal belangrijk zijn voor het begrijpen van complexe mechanismen die betrokken zijn bij cutane weefsel reparatie en essentieel voor het testen van nieuwe therapeutische middelen. De in vitro modellen van wondgenezing zijn niet in staat om de complexiteit van het cutane weefsel nauwkeurig na te bootsen. De in vivo diermodellen zijn een onmisbaar onderzoeksinstrument om inzicht te krijgen in de mechanismen die betrokken zijn bij weefselherstel.

Verschillende methoden van huidtransplantatie techniek werden ontwikkeld bij knaagdieren om chirurgische excisie na te bootsen en brandwond reconstructie7,8,9. Echter, de meeste van de eerder beschreven procedures niet leiden tot een thermische brandwond voorafgaand aan de huid enten. In plaats van de brandwond werd een volledige dikte excisional wond geïnduceerd, die vervolgens werd gereconstrueerd met een volledige dikte huid allograft7. Verschillende anatomische oriëntatiepunten zoals het oor, staart en rug zijn gebruikt voor het oogsten van de donorhuid bij knaagdieren7,8. Verschillende graft fixatie en stabilisatie technieken werden gemeld, waaronder een “geen hechting techniek”9, hechtingen7 en chirurgische lijm10,11,12.

Het doel van deze studie was om een murine model van een volledige dikte burn wond die de huidige gouden standaard benadering in de behandeling van branden zou recapituleren, waarbij niet-levensvatbare weefsel excisie en huidtransplantatie. Een thermische brandwond werd veroorzaakt op het dorsumoppervlak van een muis met behulp van een voorverwarmde messing sjabloon. Brand eschar werd uitgesneden en vervangen door een volledige dikte graft geoogst uit de staart van een donor muis. Dit experimentele model heeft drie belangrijke voordelen. Ten eerste kunnen meer dan één brandwond op de rug van de ontvangende muis worden geïnduceerd en kunnen vier donorhuidtransplantaties worden geoogst uit een enkele staart van de donormuis. Dit betekent dat verschillende experimentele en controlebehandelingen mogelijk kunnen worden vergeleken met dezelfde ontvanger en donordieren. Afhankelijk van de gewenste toedieningsroute kan de controlebehandeling lokale of systemische toediening van het voertuig of placebocontrole omvatten (bijvoorbeeld actuele toepassing van zalf, onderhuidse, intraperitoneale of intraveneuze injectie van oplossing). Ten tweede kunnen de timing van de behandeling en het eindpunt van het experiment worden gecontroleerd. Ten derde, dit model is afhankelijk van de reconstructie van wonden met behulp van volledige dikte grafts geoogst uit de staart, waarvan bekend is dat een grotere kans op succesvolle integratie in de donor site in vergelijking met de huid geoogst uit de rug13. Dit kan te wijten zijn aan het lagere aantal opperhuid Langerhans cellen, die een belangrijke rol spelen in cutane immunobiologie, en worden geassocieerd met de huidtransplantatie afwijzing14.

Het voorgestelde model van wondgenezing en graftintegratie kan goed worden toegepast op transgene en knock-out muizen. Het gebruik van genetisch gemodificeerde muizen zal helpen bij het ophelderen van de rollen die bepaalde genen kunnen spelen tijdens wondherstel. Exogene toepassing van actuele wondpreparaten of onderhuidse toediening van therapeutische antilichamen op de plaats van de schade kan ook worden overwogen.

Door technische problemen zijn huidtransplantaties van gespleten diktes bestaande uit de opperhuid en een deel van de dermis moeilijk te verkrijgen bij muizen. Volledige dikte huidtransplantaties bestaande uit de opperhuid en volledige dikte dermis is bekend dat een goed gevasculariseerde wondbed nodig voor een succesvolle integratie. Het onvermogen om gespleten dikte huidtransplantaties oogsten in muizen kan worden beschouwd als een beperking van dit model. De fixatie van de huidtransplantatie aan het wondbed van de ontvanger werd bereikt door de toepassing van de chirurgische lijmlijm, die gepaard gaat met minder trauma en snelle afbraak in vergelijking met andere middelen van weefselfixatie15. Eerdere studies hebben aangetoond dat hechten wordt geassocieerd met sterkere weefselfixatie dan de chirurgische lijm op 24 uur na de chirurgische ingreep15, die kan worden beschouwd als een nadeel van de procedure. Echter, op latere timepoints, de biomechanische sterkte van wonden behandeld met een chirurgische lijm wordt vergelijkbaar met hechtingen15 en beter dan nietje fixatie16. Na weefselfixatie met de chirurgische lijm moeten wonden worden bedekt met een wondverband. Hoewel wonden op het rugoppervlak van de muis moeilijk te bereiken zijn voor het dier, is het wondverband daarentegen gemakkelijk te manipuleren en te verwijderen door het dier. Frequente veranderingen in de wondverband kunnen gerechtvaardigd zijn.

Anesthesie-geïnduceerde onderkoeling bij kleine knaagdieren is een goed gedocumenteerd fenomeen17. Hypothermie is een bijwerking van deze procedure, die complicaties veroorzaakt, en mogelijk compromissen brengt, zowel de gezondheid van dieren en de kwaliteit van de gegevens. Daarom garandeert deze methode de implementatie van temperatuurbeheerstrategieën, vooral als haarloze SKH1-Hrhr wordt gebruikt.

De belangrijkste beperking van het gebruik van muizen om menselijke wondsluiting na te bootsen is het verschil tussen de huidanatomie en fysiologie. Muiswonden genezen meestal via samentrekking, terwijl menselijke wonden genezen door granulatieweefselvorming en re-epithelialisatie18. Om rekening te houden met deze discrepantie, kan het huidige model worden gewijzigd en gebruikt in combinatie met een splinting ring strak gehecht rond de wond om te voorkomen dat de huid contractie19. Gezien een aantal voor- en nadelen van dit in vivo protocol, kan dit model dienen als een hulpmiddel om bepaalde processen te bestuderen die betrokken zijn bij wondgenezing die onmogelijk in vitro te bestuderen zijn.

Protocol

Alle experimenten werden goedgekeurd door het Franse ministerie van Hoger Onderwijs en Onderzoek (Studienummer: 122162017111617670v2 en DAP180012). Alle muizen waren eenpersoonshuis bij aankomst in plastic kooien en mochten een 7-daagse acclimatisatieperiode voorafgaand aan de studie. De dierenkamer werd onderhouden bij een 12/12 uur licht/donker cyclus (lichten op om 07:00). Eten en kraanwater waren ad libitum verstrekt. BALB/c en SKH1-Hrhr muizen kregen een traditioneel tarwe-/sojadieet. Zaagsel beddengoed werd verstrekt samen met nestmateriaal. 1. Voorbereiding van de uitrusting Bereid een brandapparaat voor op de procedure en stel deze in op 80 °C met behulp van de temperatuurregelaar (figuur 1A). Controleer de temperatuur van de koperen sjabloon(figuur 1B,C) met behulp van de infrarood warmtebeeldcamera. Zorg ervoor dat de digitale manometer correct werkt. Bedek het podium met een chirurgisch laken en pas de hoogte van de tafel aan(figuur 1A). 2. Preoperatieve en intraoperatieve dierverzorging Verwerf BALB/c en SKH1-Hrhr muizen, 6-8 weken oud. Voeg paracetamol suspensie met 3 mg/mL toe aan het drinkwater en 12 uur voor en tot 72 uur na de procedure. Met behulp van een spuit van 1 mL en een naald van 26 G, die buprenorfine onderhuids toedient op 0,05 μg/g 30 min voor de procedure en elke 6 uur gedurende de eerste 72 uur na de procedure. Met behulp van een 1 mL spuit en een 26 G naald, toedienen lidocaïne aan de dorsum van de muis en 2-3 mm distaal naar het gebied van de brandwond. Injecteer lidocaïne op 0,05 μg/g onderhuids 15 min voor de inductie van de brandwond. Verdoven muizen met behulp van een intraperitoneale injectie van xylazine bij 10 mg/kg en ketamine 100 mg/kg. Gebruik een spuit van 1 mL en een naald van 26 G om de injectie toe te dienen. Kritieke stap: Plaats de verdoofde muis op een verwarmde stootkussen en houd de muis warm om onderkoeling te voorkomen gedurende de eerste 30 minuten na de inductie van anesthesie en gedurende ten minste 15 minuten na het herstel van anesthesie. Naast de verwarmde pad, andere modaliteiten, waaronder warmtelampen,circulerende warme vloeistoffen of lucht, en voorverwarmde warmte reservoirs kunnen worden gebruikt om de lichaamstemperatuur te regelen. Breng smeringgel aan op de ogen van de muis om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen. Gebruik de teenknijprekreflex om de diepte van anesthesie te beoordelen. Met behulp van een 1 mL spuit en een 26 G naald beheren 200 μL lactated ringer’s Solution aangevuld met 5% dextrose. Beheer vochtvervanging onderhuids onmiddellijk na de inductie van anesthesie en 6 uur na de procedure om uitdroging te voorkomen. 3. Volledige dikte brandwonden wondinductie Scheer de verdoofde muis met de haarknippers. Breng de ontharingscrème gedurende 1 minuut aan op het dorsumoppervlak van de muis. Veeg de room af met wat steriel gaas en maak het gebied schoon met een stuk vochtig gaas. Dep de huid met wat gaas tot het droog is. Plaats de muis op het podium bedekt met een chirurgische gordijnen en beweeg het podium naar boven dichter bij de voorverwarmde messing sjabloon. Breng de cirkelvormige messingsjabloon aan op de achterkant van de muis (80 °C voor 20 s) met een constante druk van 0,15 N (figuur 2). Kritieke stap: Plaats onmiddellijk na de brandinductie het verdoofde dier op de verwarmde pad om onderkoeling te voorkomen en de muis warm te houden tijdens en na de procedure. Eenmaal hersteld van anesthesie, terug te keren naar de kooi. Kritieke stap: Zorg voor een gestampt dieet op de kooi vloer voor de eerste 72 uur na de chirurgische ingreep. Muizen zijn soms terughoudend om te bereiken tot een sipper buis om water te drinken na een burn wound letsel. 4. Oogsten van het donortransplantaat Maak een longitudinale incisie met een scalpel in het bovenste deel van de staart van de donormuis en verwijder de huid voorzichtig met chirurgische tangen. Plaats de staarthuid in een steriele petrischaal gevuld met 10 mL steriele 0,9% zoutoplossing. Gebruik een liniaal om individuele grafts uit te meten en snijd de staarthuid in stukken, elk met een lengte van 15 mm, met behulp van een scalpel. Na bereidheid houdt u de huidtransplantaties tot 2 uur in 0,9% zoutoplossing bij 4 °C. 5. Chirurgische excisie en huidtransplantatie Vierentwintig uur na de brandinductie, bereid de muis voor op anesthesie door inademing van isoflurane. Plaats de muis in de inductiekamer en induceer anesthesie met behulp van 5% isoflurane in 100% zuurstof bij een stroomsnelheid van 4 L/min. Gebruik 2% isoflurane bij 2 L/min om anesthesie tijdens de operatie te behouden. Plaats een chirurgische gordijn op de muis en snijd een raam om het chirurgische veld bloot te leggen. Met behulp van de aseptische techniek, wattenstaafje de wond eerst met povidone-jodium en vervolgens met 70% alcohol. Pak voorzichtig het verbrande weefsel op met een paar chirurgische pincet en verdeelt alle necrotische en niet-levensvatbare weefsel met steriele chirurgische schaar en pincet. Verwijder de panniculus carnosus laag van de hypodermis om een stabiel ontvanger bed te creëren. Plaats de huidtransplantatie op het vers bereide wondbed. Trek voorzichtig de omringende huid naar de huidtransplantatie met behulp van chirurgische pincet. Breng wat chirurgische lijm aan om het transplantaat aan het wondbed te bevestigen en druk voorzichtig om de huidranden uit te lijnen. Kritieke stap: De grootte van het wondbed moet iets groter zijn dan de grootte van de huidtransplantatie om een succesvolle engraftment te garanderen. Laat de muis herstellen van anesthesie. Kritieke stap: Plaats de muis op een verwarmd pad. Houd de muis warm tijdens en na de procedure om onderkoeling te voorkomen. Breng inert paraffine gaasverband aan en lijm secundair verband over de geënte wond. Plaats de muis in een individuele kooi. Kritieke stap: Geef de eerste 72 uur na de chirurgische ingreep een aardappeldieet op de kooivloer en controleer dagelijks. Zorg voor speelgoed en verrijk het milieu. 6. Digitale beeldvorming en postmortem wondverzameling Fotografeer wonden met een digitale camera door een liniaal naast de wond te plaatsen(figuur 3). Aan het eindpunt van het experiment, euthanaseren dieren door blootstelling aan kooldioxide en cervicale dislocatie. Kritieke stap: Overmatige trekactie van de huid tijdens de cervicale dislocatie kan het transplantaat beschadigen. Bij post-mortem, operatief accijns de rug brandwonden aan de fascia met behulp van een schaar. Bisect wonden. Fix de helft in 10% gebufferd formaline en proces voor histologie en immunohistochemie. Bevries de andere helft snel in vloeibare stikstof voor RNA-extractie en eiwitkwantificering en houd op -80 °C. 7. Huidhistologie, immunohistochemie en collageenvisualisatie Sluit huidmonsters in paraffine, snijd tot 4 μm secties en plaats op positief geladen dia’s. Gebruik dia’s bevlekt met hematoxylin en eosine om de snelheid van re-epithelialisatie (% van de oorspronkelijke wond) te evalueren. Het gebied van de wond dat bedekt is met neo-opperhuid kan worden uitgedrukt als een percentage van de gehele wond (figuur 4). Gebruik een digitale microscoopapplicatie en ImageJ-software om de microscopische analyse van de secties uit te voeren. Gebruik histologische secties (4 μm dikte) bereid uit formaline vast en paraffine ingebed weefsel en onder voorbehoud van immunohistochemie. Om collageen I en fibronectine expressie in wonden te beoordelen, passen primaire antilichamen en incubate voor 1 uur. Detectie kan worden uitgevoerd door soort-specifieke mierikswortel peroxidase (HRP) of alkalische fosfatase (AP)-geconjugeerde secundaire antilichamen. Reageersecties met: i) HRP,3,3′-diaminobenzidine (DAB) of (ii) AP, Bond Polymer Refine Red (Table of Materials), die een felrode kleur oplevert(figuur 5). Scan de secties met behulp van een instrument en analyseer met de digitale microscoop applicatie en ImageJ. Om histologische beoordeling van collageendepositie mogelijk te maken, voert u trichrome vlekken uit op histologische secties met behulp van een commerciële kit. Voor collageenvezelvisualisatie gebruikt u multifoton microscopie en tweede harmonische generatietechniek(figuur 5). Gebruik een multifoton microscoop voor weefsel beeldvorming zoals eerder beschreven20. Gebruik een Ti: Sapphire laser met een middengolflengte op 810 nm als de laser bron voor het genereren van tweede harmonische en twee-foton opgewonden fluorescentie signalen (TPEF). Gebruik een laserstraal uitgerust met een doelstelling van 25x/0,95 W om de tweede harmonische generatie (SHG) en TPEF te verzamelen en te prikkelen. Detecteer signalen zoals eerder beschreven21 door NDD PMT detectoren. Gebruik software voor laserscancontrole en beeldverwerving.

Representative Results

De resultaten tonen aan dat het protocol ontwikkeld is een eenvoudige methode, die het mogelijk maakt de inductie van een volledige dikte branden wond in muizen. Brandwonden worden geïnduceerd met behulp van een voorverwarmde messing sjabloon(figuur 1A-C). Het verbrande gebied verschijnt als een cirkelvormige wond met een witte eschar en een hyperemische zone. De grootte van de brandwondenwond is iets groter op 24 uur na de brandwonden als gevolg van het goed beschreven fenomeen dat bekend staat als de progressie van het brandwondenletsel, wat mogelijk te wijten is aan acute ontsteking22. Na excisie worden brandwonden gereconstrueerd met behulp van allogene huidtransplantatie(figuur 3). Op dag 7 na de brandwondenverwonden worden wonden vascularized5, wat een indicatie is van succesvolle engraftment. Epidermale keratinocyten migreren van de aangrenzende ontvangende huid in de poging om de wond te sluiten en de kloof tussen de twee randen van de wonden te overbruggen. Microscopische analyse van H en E gekleurde sectie van wonden bleek dat de lengte van de neo-opperhuid aanzienlijk langer wordt op dag 7 na brandwonden in vergelijking met dag 3 na brandwonden(Figuur 4B). Voorafgaand aan het uitvoeren van een grote studie, is het ten zeerste aanbevolen dat onderzoekers een pilot studie voltooien, die het mogelijk maakt de exploratie van een nieuwe interventie, beoordeling van de haalbaarheid, de identificatie van wijzigingen in de methode om reproduceerbaarheid te garanderen. Statistisch significante effecten zijn moeilijk op te sporen in kleinere monsters, terwijl het vergroten van de steekproefgrootte een manier is om de statistische kracht van een test te vergroten. Om bijvoorbeeld een statistisch significant verschil (p < 0,05) in de snelheid van wondherepithelialisatie(figuur 4) tussen groepen te detecteren, moet de steekproefgrootte tussen zes en acht muizen per groep liggen. Alle experimenten moeten ten minste tweemaal worden herhaald. Als matrixproducerende cellen, zoals fibroblasten, migreren van het ontvangende weefsel naar het transplantaat, worden de belangrijkste componenten van de extracellulaire matrix, waaronder collageen I en fibronectine, sterk uitgedrukt in de nieuw gevormde matrix(figuur 5). Figuur 1: Installatie van het apparaat branden. (A) Plaatsing en opstelling van het brandapparaat. Het brandapparaat is aangesloten op de temperatuurregelaar en is aan de digitale monometer bevestigd om de druk te kunnen monitoren. Het brandapparaat hangt boven een verstelbaar podium – vlak oppervlak waarop muizen worden geplaatst voor de inductie van verbranding. (B-C) Een close-upbeeld van de messing sjabloon die wordt gebruikt om wondbrandwonden te veroorzaken. (C) De diameter van de messing sjabloon is 1 cm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 2: Schematische illustratie van de verschillende stappen die nodig zijn om het experimentele model te reproduceren dat in dit artikel wordt beschreven. Er zijn drie belangrijke stappen aan de procedure: (i) inductie van de brandwond met behulp van een voorverwarmde messing sjabloon; ii) chirurgische excisie van het niet-levensvatbare necrotische weefsel op 24 uur na het brandwondenverwonding; iii) chirurgische wondreconstructie met behulp van een allogene huidtransplantatie met volledige dikte, geoogst van een donormuis. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 3: De macroscopische weergave van gereconstrueerde muizenbrandwonden. Representatieve digitale beelden van brandwonden gereconstrueerd met allogene huidtransplantaties op dagen 0, 1, 3 en 7 na brandwonden. De liniaal op beelden is in millimeters. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 4: Microscopisch uiterlijk van wonden op 3 en 7 dagen na brandwonden. H&E-gekleurde delen van wonden 3 en 7 dagen na brandwonden. De lengte van neo-opperhuid (stippellijn) wordt aanzienlijk verhoogd in (A) dag 3 wonden in vergelijking met (B)dag 7 wonden. In (A) en (B) bedraagt de schaalbalk 100 μm. (C) Grafische weergave van het percentage wondherepitheelvorming. Dit werd geëvalueerd door het meten van de lengte van neo-opperhuid op dag 3 en 7 na de brandwond letsel en uitgedrukt als een percentage van de gehele wondlengte. De resultaten vertegenwoordigen gemiddelde ± S.E.M. (n = 6 muizen in groep dag 3; n = 6 muizen in groep dag 7, *p < 0,05; Student's t-test). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken. Figuur 5: Beoordeling van de extracellulaire matrix en collageen I visualisatie. Representatieve beelden van immunohistochemie analyse op dag 7 muiswonden gekleurd voor (A) collageen en (B) fibronectin. Let op intense rode vlekken in langwerpige spindelvormige collageen I-positieve cellen. Let op bruine vlekken in fibronectine-positieve cellen in de dermis van dag 7 wonden. Schaalbalk = 50 μm in alle afbeeldingen. In (A) en (B) duidt e opperhuid en d duidt dermis aan. (C) Visualisatie van collageenvezels en histologische beoordeling van collageendepositie. (D) Representatieve TPEF/SHG collageen beeld van dag 7 muiswonden. Gelijktijdige TPEF/SHG-acquisitie met behulp van circulaire polarisatie en SHG-signalen werden selectief verwerkt om een binaire distributie van SHG te verkrijgen na het toepassen van een drempelwaarde. TPEF beelden (groen) en SHG beelden (wit) waren pseudo-gekleurd en bedekt. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Volgens de dikteclassificatie van brandwonden23worden brandwonden op volle dikte gekenmerkt door duidelijke betrokkenheid van de gehele dikte van de huid en een bepaald deel van het onderhuidse weefsel. Dit type wond kan alleen genezen door contractie of met huidtransplantatie2. Een inherente beperking van de methode beschreven in dit artikel is dat alleen volledige dikte grafts, in tegenstelling tot de gespleten dikte grafts, die vaak worden gebruikt in de klinische omgeving, werden geoogst uit de staart van een muis. Dit was te wijten aan de technische moeilijkheid, omdat de muis huid is te dun om gespleten dikte grafts te verkrijgen. Er moet op worden gewezen dat volledige diktetransplantaten een goed gevasculariseerd wondbed vereisen, terwijl gespleten dikte huidtransplantaten in staat zijn om te overleven op donorlocaties met minder vasculariteit24. Eerdere studies toonden aan dat een brandwond veroorzaakt op de achterkant van de muis werd geassocieerd met een robuuste vorming van nieuwe vasculatuur5. Dit suggereert dat een goed gevasculariseerd gebied, zoals de dorsum van de muis, kan worden beschouwd als de anatomische mijlpaal voor de inductie van brandwonden.

Burn wond diepte is een belangrijke factor om te overwegen. De diepte van de brandwond moet consistent zijn tussen individuele muizen. De reproduceerbaarheid van de brandwonddiepte hangt af van de temperatuur van het koperen sjabloon, de druk en de duur van de blootstelling aan de hitte. De diepgang van de brandwondenwond moet histologisch worden geverifieerd. Het is belangrijk om in gedachten te houden dat overmatige druk of langdurige blootstelling van de huid aan de voorverwarmde messing sjabloon het onderliggende weefsel kan verwonden. Het weefsel rond de wervelkolom, met inbegrip van de componenten van het centrale en perifere zenuwstelsel, zijn gevoelig voor warmte, en als beschadigd kan leiden tot achterbeenverlamming.

Hoewel geen postoperatieve mortaliteit direct verband hield met de chirurgische ingreep, ontwikkelde een klein aantal haarloze SKH1-Hrhr muizen, die bijzonder gevoelig zijn voor kou, onderkoeling en herstelden na de algemene anesthesie. Daarom moet aanvullende warmte worden geleverd tijdens alle esthetische gebeurtenissen en constante bewaking is vereist, terwijl de muis wordt verdoofd.

De methode beschreven in deze studie was niet geassocieerd met de chirurgische site infectie. Aseptische techniek moet echter worden gebruikt om de overdracht van micro-organismen in de chirurgische wond tijdens de perioperatieve periode te voorkomen. Inenting van de wond met bioluminescente of fluorescerende micro-organismen kan in de procedure worden opgenomen. Deze techniek kan nuttig zijn bij het bestuderen van infectieuze organismen en hun pathogenese25. Zo kan bijvoorbeeld exogene toevoeging of injectie van bioluminescente bacteriën de microbiële belasting kunnen kunnen controleren met behulp van de in vivo hele beeldvorming van dieren25. Gezien het feit dat muis haar is bekend dat interfereren met de in vivo hele dierlijke fluorescentie en bioluminescentie beeldvorming, haarloze SKH1-Hrhr muizen zijn ideale gastheren voor de studies waarbij fluorescerende of bioluminescente verslaggevers.

Wondweefselmonsters kunnen op verschillende tijdstippen worden verzameld en verwerkt voor histologische en immunohistochemische analyse. Eiwit en RNA kunnen worden geïsoleerd uit de huidbiopsie en moleculaire biologie technieken kunnen worden gebruikt om de expressie van belangrijke moleculen die betrokken zijn bij wondgenezing te beoordelen.

In de huidige studie beschreven we een experimenteel model van burn wound healing en allogene huidgraftment. Deze procedure kan worden gewijzigd en dienen als een model voor preklinische studies.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door La Direction Générale de L’Armement, l’Agence de l’Innovation de Défense en École Polytechnique. Wij danken onze collega Yann Plantier van École Polytechnique die inzicht en expertise heeft verschaft die de productie van het videobestand enorm hebben geholpen. De auteurs danken de heren Benoit Peuteman en Charlotte Auriau van INSERM Lavoisier (SEIVIL) US 33, Hôpital Paul Brousse, Villejuif voor hun deskundigheid op het gebied van dierlijk welzijn en verzorging die in de loop van dit project worden geleverd.

Materials

1 ml syringue Terumo SS + 01T1
26 G needle Terumo Agani NN-2613R 1/2'' – 0,45 X 12mm
96X21 mm Petri Dish Dutscher 193199
Animal Weighing scale Kern EMB 5.2K5
BALB/c mouse Janvier labs BALB/cAnNRj 6-weeks old
Biopsy foam pads 30.2X25.4X2mm Simport M476-1
Bond polymer Refine Red Leica Biosystems DS9390
Brass block BVG custom-designed Circular 10 mm in diameter
Buprenorphine (BUPRECARE) Axience FR/V/6328396 3/2011 administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g
Burning apparatus Kausistar 400 TraçaMatrix 34010
CaseViewer 3DHISTECH Ltd. 3Dhistech, Budapest, Hungary
Collagen I antibody Abcam ab34710 Recommanded concentration 1:50; 1:200
D-(+)- glucose (Dextrose) Sigma Aldrich G-8769-100 ml
DAB Leica Biosystems AR9432
Digital camera NIKON D3400 objective: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45
Depilating cream Veet
Disposable scalpels Swann Morton 6601
DPBS PAN biotech P04-36300
Ethanol absolute VWR chemicals 20821.310
Fibronectin antibody Abcam ab23750 Recommanded dilution 1:1000
Filter 0.22um Sartorius 16532
Fine Scissors F.S.T. 14094-11
Forceps Dumont F.S.T. 11295-10
Hair clippers AESCULAP B00VAQ4KUY (ISIS)
Heating pad Petelevage 120070
Isofluorane Piramal healthcare FR/V/03248850/2011
Ketamine Imalgene FR/V/0167433 4/1992 surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 100mg/kg
Lactated Ringers solution Flee-Flex 1506443
Lamina multilabel slide scanner Perkin Elmer
LAS software Leica version 2.7.3
Leica Bond III Leica Biosystem 1757
Leukosilk dressing BSN medical 72669-01
Lidocaine Aguettant N01BB02 local analgesic, administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g
Manometer Kern HDB-5K5
Masson Trichrome Staining kit Sigma-Aldrich HT15-1KT
Micromesh Biopsy cassettes Simport M507
Multiphoton inverted stand Leica SP5 microscope Leica microsystems DM500 Scanner 8000Hz NDD PMT detectors
Non adhering dressing Adaptic Systagenix A6222 12.7cm X 22.9 cm
Ocrygel Tvm France ###
Paracetamol 300mg Dolliprane Liquiz
Paraformaldheyde 4% VWR chemicals 1169945
Povidone-iodine MEDA pharma D08AG02 diluted to 1:2
SKH1-Hrhr mouse Charles river 686SKH1-HR 6-weeks old
Slides Thermoscientific AGAA000080
Surgical adhesive BSN medical 9927
Sterile Gauze Hartmann 418545/9 10 X 10 cm
Sterile water Versylene Fresenius B230521
Surgical drape Hartmann 2775161
Ti:Sapphire ChameleonUltra Coherent DS 16-02-16 F 690-1040 nm
Thermal imaging Camera Testo Testo 868
Xylazine (Rompum 2%) Bayer FR/V/ 8146715 2/1980 surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shakir, S., et al. Indications and Limitations of Bilayer Wound Matrix-Based Lower Extremity Reconstruction: A Multidisciplinary Case-Control Study of 191 Wounds. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2019).
  2. Greenhalgh, D. G. Management of Burns. New England Journal of Medicine. 380 (24), 2349-2359 (2019).
  3. Bosse, M. J., et al. An analysis of outcomes of reconstruction or amputation after leg-threatening injuries. New England Journal of Medicine. 347 (24), 1924-1931 (2002).
  4. Braza, M. E., Fahrenkopf, M. P. . StatPearls. , (2019).
  5. Duchesne, C., Banzet, S., Lataillade, J. J., Rousseau, A., Frescaline, N. Cold atmospheric plasma modulates endothelial nitric oxide synthase signalling and enhances burn wound neovascularisation. Journal of Pathology. 249 (3), 368-380 (2019).
  6. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), 266 (2014).
  7. Pakyari, M., et al. Local Expression of Indoleamine 2,3, Dioxygenase Prolongs Allogenic Skin Graft Take in a Mouse Model. Advances in Wound Care. 8 (2), 58-70 (2019).
  8. Pakyari, M., et al. A new method for skin grafting in murine model. Wound Repair and Regeneration. 24 (4), 695-704 (2016).
  9. McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Current Protocols in Immunology. , (2009).
  10. Cristobal, L., et al. Local Growth Hormone Therapy for Pressure Ulcer Healing on a Human Skin Mouse Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), (2019).
  11. Melican, K., Aubey, F., Dumenil, G. Humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
  12. Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
  13. Larsen, C. P., et al. Migration and maturation of Langerhans cells in skin transplants and explants. Journal of Experimental Medicine. 172 (5), 1483-1493 (1990).
  14. Leonard, D. A., Kurtz, J. M., Cetrulo, C. L. Vascularized composite allotransplantation: towards tolerance and the importance of skin-specific immunobiology. Current Opinion in Organ Transplantationt. 18 (6), 645-651 (2013).
  15. Stoikes, N., et al. Biomechanical evaluation of fixation properties of fibrin glue for ventral incisional hernia repair. Hernia: The Journal of Hernias and Abdominal Wall Surgery. 19 (1), 161-166 (2015).
  16. Foster, K., et al. Efficacy and safety of a fibrin sealant for adherence of autologous skin grafts to burn wounds: results of a phase 3 clinical study. Journal of Burn Care & Research. 29 (2), 293-303 (2008).
  17. Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (5), 577-583 (2013).
  18. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models of Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
  19. Wang, X., Ge, J., Tredget, E. E., Wu, Y. The mouse excisional wound splinting model, including applications for stem cell transplantation. Nature Protocols. 8 (2), 302-309 (2013).
  20. Ruzehaji, N., et al. Pan PPAR agonist IVA337 is effective in prevention and treatment of experimental skin fibrosis. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (12), 2175-2183 (2016).
  21. Ruzehaji, N., et al. Combined effect of genetic background and gender in a mouse model of bleomycin-induced skin fibrosis. Arthritis Research & Therapy. 17, 145 (2015).
  22. Singer, A. J., Burn Boyce, S. T. Wound Healing and Tissue Engineering. Journal of Burn Care & Research. 38 (3), 605-613 (2017).
  23. Shakespeare, P. Burn wound healing and skin substitutes. Burns. 27 (5), 517-522 (2001).
  24. Sun, B. K., Siprashvili, Z., Khavari, P. A. Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds. Science. 346 (6212), 941-945 (2014).
  25. Miller, R. J., et al. Development of a Staphylococcus aureus reporter strain with click beetle red luciferase for enhanced in vivo imaging of experimental bacteremia and mixed infections. Scientific Reports. 9 (1), 16663 (2019).

Tags

Murine ModelBurn WoundAllogeneic Skin GraftFull Thickness BurnSkin GraftThermal Burn Injury DeviceEpidermisDermisSubcutaneous FatSuperficial BurnsPartial Thickness BurnsFull Thickness BurnsSkin GraftingDonor MouseRecipient MouseInbred StrainHairless MiceWound HealingInfectionBacterial GrowthThermal Imaging Camera

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Blaise, O., Duchesne, C., Banzet, S., Rousseau, A., Frescaline, N. A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft. J. Vis. Exp. (162), e61339, doi:10.3791/61339 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image