同種異系皮膚移植片で再建された火傷のマウスモデル

すべての実験はフランス高等教育研究省によって承認されました (研究番号: 122162017111616517670v2 と DAP180012).すべてのマウスは、プラスチックケージに到着すると一人収容され、研究の前に7日間の順応期間を許可された。動物室は12/12時間の明暗サイクル(07:00に点灯)で維持されました。食べ物と水道水は、アドリビタムを提供しました。BALB/cおよびSKH1-Hrhrマウスは、伝統的な小麦/大豆ベースの食事を与えた。おがくずの寝具は、入れ子材料と一緒に提供されました。 1. 設備準備 プロシージャのための燃焼装置を準備し、温度コントローラーを使用して80°Cに設定します(図1A)。赤外線熱画像カメラを使用して、真鍮テンプレートの温度(図1B,C)を確認します。 デジタル・マノメーターが正しく動作していることを確認します。 ステージを外科用ドレープで覆い、テーブルの高さを調整します(図1A)。 2. 術前及び手術中の動物ケア BALB/cおよびSKH1-Hrhrマウスを取得します, 6-8週齢. 3 mg/mLのパラセタモール懸濁液を飲料水に加え、処置の12時間前と72時間前まで供給する。 1 mLシリンジと26G針を使用して、手順の30分前に0.05 μg/gの下皮下投与し、手順の後の最初の72時間は6時間ごとに投与します。 1 mLシリンジと26G針を用いて、リドカインをマウスのドーサムに投与し、2~3mmの熱傷の領域に遠位を投与する。焼け傷の誘導の15分前に0.05 μg/g皮下にリドカインを注入する。 10 mg/kg のキシラジンおよびケタミン 100 mg/kg で腹腔内注射を使用してマウスを麻酔します。.注射剤を投与するために1mLの注射器と26G針を使用してください。 重要なステップ:麻酔後の最初の30分間、麻酔からの回復後、少なくとも15分間、加熱されたパッドの上に麻酔マウスを置き、マウスを暖かく保ち、低体温症を予防します。加熱されたパッドに加えて、ヒートランプ、循環暖かい液体または空気、および事前に暖めた熱貯留層を含む他のモダリティは、体温を調節するために使用することができる。 角膜の脱水を防ぐために、マウスの目に潤滑ゲルを塗布します。 つま先ピンチ離脱反射を使用して、麻酔の深さを評価します。 1 mL シリンジと 26 G 針を使用して、5% デキストロースを補った 200 μL のラクチンジャー溶液を投与します。麻酔の誘導直後に皮下に水分置換を行い、脱水を予防する処置の6時間後に投与する。 3.完全な厚さの傷の誘発を燃やす 毛のバリカンで麻酔マウスを剃ります。 マウスのドーサム表面に脱毛クリームを1分間塗布します。いくつかの滅菌ガーゼを使用してクリームを拭き取り、湿ったガーゼの一部で領域をきれいにします。肌にガーゼを入れ、乾くまで乾かします。 手術用ドレープで覆われたステージにマウスを置き、ステージを予熱した真鍮テンプレートに近づけます。 0.15 Nの一定圧力を使用して、マウスの背面(20の場合は80°C)に円形の真鍮テンプレートを適用します(図2)。 重要なステップ:火傷誘導の直後に、麻酔動物を加熱パッドに置いて低体温症を防ぎ、処置中および後にマウスを暖かく保つ。麻酔から回復したら、マウスをケージに戻します。 重要なステップ:外科的処置の後の最初の72時間のケージの床にマッシュダイエットを提供する。マウスは、火傷の怪我の後に水を飲むためにシッパーチューブに到達することに消極的になることがあります。 4. ドナー移植片の収穫 ドナーマウスの尾部の上部にメスを入れた縦切開を行い、外科用鉗子を使用して皮膚をそっと取り除きます。 10 mLの無菌0.9%生理食水で満たされた無菌ペトリ皿に尾の皮を入れます。定規を使用して個々の移植片を測定し、メスを使用して15mmを測定する尾の皮膚を粉々に切ります。 調製後、皮膚移植片を最大2時間4°Cで0.9%生理食液に保ちます。 5. 外科的切除と皮膚移植 焼け入れから24時間後、イオブルランを吸入して麻酔のためにマウスを準備する。マウスを誘導室に入れ、4 L/minの流量で100%酸素中の5%イオブルランを使用して麻酔を誘発する。手術中に麻酔を維持するには、2 L/分で2%イソファランを使用してください。 マウスに外科用ドレープを置き、外科的分野を露出させるために窓を切り取ります。無菌技術を用いて、最初にポビドネヨウ素で創傷を綿棒し、次に70%のアルコールで傷を綿棒にする。 穏やかに外科用ピンセットのペアで焼かれた組織を拾い、無菌の外科用はさみおよびピンセットとすべての壊死および非実行可能なティッシュを切除する。皮下のパンニクルカルノーサス層を取り除き、安定した受け取りベッドを作成します。 作りたての創傷ベッドの上に皮膚移植片を置きます。外科用ピンセットを使用して、周囲の皮膚を皮膚移植片に向かってそっと引っ張ります。いくつかの外科用接着剤を塗布して、移植片を創傷床に取り付け、静かに押して皮膚の縁を合わせます。重要なステップ:創傷床のサイズは、正常な生着を確実にするために、皮膚移植片のサイズよりもわずかに大きくなければなりません。 マウスが麻酔から回復することを許可します。クリティカルステップ:熱いパッドの上にマウスを置きます。低体温症を防ぐために、手順の間と後にマウスを暖かく保ちます。 移植された創傷の上に不活性パラフィンガーゼドレッシングおよび接着二次ドレッシングを適用する。 マウスを個々のケージに入れます。重要なステップ:外科的処置の後の最初の72時間ケージの床にいくつかのマッシュダイエットを提供し、毎日監視します。 おもちゃを提供し、環境を豊かにします。 6. デジタル画像化と事後創傷コレクション 傷の横に定規を置いて、デジタルカメラで傷を撮影する(図3)。 実験の終点で、二酸化炭素および子宮頸部脱臼に曝されることによって動物を安楽死させる。重要なステップ: 子宮頸部脱臼時の皮膚の過剰な引っ張り作用は、移植片に損傷を与える可能性がある。 死後、はさみを使用して鼻隠しに背びけの傷を外科的に切除する。二分の傷。10%緩衝ホルマリンとプロセスで半分を修正し、神学と免疫検査を行います。RNA抽出とタンパク質定量のために液体窒素で残りの半分を速く凍結し、-80°Cに保ちます。 7. 皮膚構造学、免疫染色法、コラーゲン可視化 パラフィンに皮膚のサンプルを埋め込み、4μmのセクションにカットし、正に帯電したスライドに置きます。 ヘマトキシリンとエオシンで染色されたスライドを使用して、再上皮化の速度(元の創傷の%)を評価します。表皮で覆われている創傷の面積は、創傷全体に対する割合として表わされ得る(図4)。デジタル顕微鏡アプリケーションとImageJソフトウェアを使用して、セクションの顕微鏡分析を行います。 ホルマリン固定組織とパラフィン埋め込み組織から作られた組織学的切片(厚さ4μm)を使用し、免疫組織化学に供します。 創傷におけるコラーゲンIおよびフィブロネクチン発現を評価するために、1時間の一次抗体およびインキュベートを適用し、検出は種特異的な西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)またはアルカリホスファターゼ(AP)共役二次抗体によって行われ得る。 反応セクションは、(i)HRP、3,3′-ジアミノベンジジン(DAB)または(ii)AP、ボンドポリマー精製赤(材料表)のいずれかで反応し、明るい赤色を生み出す(図5)。機器を使用してセクションをスキャンし、デジタル顕微鏡アプリケーションとImageJで分析します。 コラーゲン沈着の組織学的評価を可能にするには、市販キットを使用して組織学的セクションにトリクローム染色を行います。 コラーゲン繊維の可視化には、多光子顕微鏡と第二高調波発生技術を用いる(図5)。先に説明した20のように組織イメージング用の多光顕微鏡を使用する。2番目の高調波および2光子励起蛍光信号(TPEF)を生成するためのレーザー源として、810 nmの中心波長を有するTi:Sapphireレーザーを使用してください。 25x/0.95 W の目的を搭載したレーザービームを使用して、第 2 高調波発生(SHG)と TPEF を収集し、励起します。NDD PMT検出器により、前述の21の信号を検出します。レーザースキャン制御と画像取得にソフトウェアを使用します。