JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Allojenik Deri Grefti ile Yeniden Yapılandırılan Yanık Yarasının Murine Modeli

Published: August 08, 2020
doi:
10.3791/61339
, , , ,
1Laboratoire de Physique des Plasmas, École Polytechnique,Sorbonne Université, CNRS, 2Institut de Recherche Biomédicale des Armées, Clamart,INSERM UMRS-MD

Summary

Bu çalışmanın amacı yanık yara iyileşmesi bir murine modeli geliştirmektir. Önceden ısıtılmış pirinç şablonu kullanılarak farelerin sırt derisinde termal yanık yapıldı. Yanmış doku debrideed ve genetik olarak benzer donör fare kuyruğundan hasat bir deri greft içip kaplandı.

Abstract

Önemsiz yüzeysel yaralar birincil niyet ile komplikasyon suz iyileşir. Derin yaralar, tam kalınlıkta yanıklar gibi, ikincil niyetle iyileşir ve cerrahi debridman ve deri greftleme gerektirir. Donör greftinin alıcı yara yatağına başarılı bir şekilde entegre edilebisi bağışıklık hücrelerinin zamanında işe alınmasına, sağlam anjiyojenik yanıta ve yeni ekstrasellüler matriks oluşumuna bağlıdır. Yara iyileşmesi ile ilgili bazı önemli süreçleri hedefleyen yeni terapötik ajanların geliştirilmesi, yara kapanmasının en iyi şekilde objektif olarak değerlendirilmesi ile güvenilir preklinik modellerin olmaması ile engellenir. Burada, allojenik deri grefti ile yeniden yapılan deneysel tam kalınlıkta yanık yarasının ucuz ve tekrarlanabilir bir modelini tanımlıyoruz. Yara, BALB/C ve SKH1-Hrhr arka planlarından gelen uyuşturulmuş yabani farelerin dorsum yüzeyine indüklenir. Yanık, çapı 10 mm olan ve önceden ısıtılmış olan ve 20 s. Yanık eschar’ı 20 s. Yanmadan 24 saat sonra eksirer ve genetik olarak benzer bir donör farenin kuyruğundan alınan tam kalınlıkta greftle değiştirilir. Prosedür için özel ekipman aranmaz ve cerrahi teknikleri n için basit bir şekilde takip edilir. Yöntem zahmetsizce uygulanabilir ve çoğu araştırma ayarlarında çoğaltılabilir. Bazı sınırlamalar modelle ilişkilidir. Teknik zorluklar nedeniyle, ince split kalınlığı deri greftlerinin hasadı mümkün değildir. Burada tanımladığımız cerrahi yöntem, tam kalınlıkta deri greftleri kullanılarak yanık yaralarının yeniden rekonstrüksiyonuna olanak sağlamaktadır. Klinik öncesi terapötik testlerin yapılmasında kullanılabilir.

Introduction

Cerrahi debridman ve deri greftleme kronik yaraların tedavisinde kullanılan yaygın klinik uygulamalardır1, yanık yaraları2, ve travmatik yaralar gibi akut yaralar3. Deri greftleme vücudun bir bölümünden sağlıklı cilt kaldırılması ve başka bir transfer içeren cerrahi işlem anlamına gelir. Donör greftleri kayıp doku yerine ve hücresel göç ve büyüme için yapısal bir iskele sağlar. Alıcı bölgeye entegre olduktan sonra, deri greftleri mikrobiyal invazu, dış ortamın zararlı etkileri ve aşırı nem kaybına karşı koruma sağlayarak kayıp cilt bariyerinin yerini alır4. Başarılı deri greftentegrasyonu çeşitli faktörlere bağlıdır. Bunlar mikrobiyal enfeksiyonlar ve inflamasyon zamanında çözüm varlığında yeterli bağışıklık yanıtları içerir, yara yerinde sağlam anjiyogenez ve alıcı yatak ve donör greft arasında vasküler anastomoz kurulması5. Greft bozulmaya başladığında, yerleşik dermal hücreler yeni hücre dışı matriks üretme yeteneğine sahip hücreler le değiştirilmelidir. Aynı zamanda, epidermal keratinositler neo-epidermis oluşturmak ve yara yeniden epitelize etmek için yeni üretilen matris üzerinde sürünmek gerekir. Bu nedenle, hücrelerin alıcı yataktan donör greftine etkin bir şekilde geçişinin başarılı greft birleşmesini etkileyen bir diğer belirleyici faktör olduğu açıktır. Yara iyileşmesinde rol oynayan çok sayıda faktör göz önüne alındığında6, etik sınırlamalar nedeniyle insan deneylerinde kontrol edilmesi imkansız olabilir, klinik öncesi deneysel deri greftleme modelleri gereklidir. Yanık yara iyileşmesi ve ilişkili deri greftleme pre-klinik modellerinin geliştirilmesi kutanöz doku onarımı ile ilgili karmaşık mekanizmaların anlaşılması için önemli olacak ve yeni terapötik ajanların test edilmesi için gerekli olacaktır. Yara iyileşmesiin in vitro modelleri kutanöz dokunun karmaşıklığını tam olarak taklit edemiyor. In vivo hayvan modelleri doku onarımı ile ilgili mekanizmaları anlamak için vazgeçilmez bir araştırma aracıdır.

Kemirgenlerde cerrahi eksizyonu taklit etmek ve yara rekonstrüksiyonu7,8,,9’utaklit etmek için çeşitli deri greftleme tekniği geliştirildi. Ancak, daha önce açıklanan prosedürlerin çoğu deri greftleme öncesinde termal yanık yaralanması neden başarısız oldu. Yanık yarası yerine, tam kalınlıkta eksizyonel yara indüklendi, daha sonra tam kalınlıkta deri allograft7ile yeniden inşa edildi. Kulak, kuyruk ve sırt gibi çeşitli anatomik yerler kemirgenler7,,8donör deri hasat için kullanılmıştır. Farklı greft fiksasyon ve stabilizasyon teknikleri bildirilmiştir, dahil olmak üzere bir “hiçbir dikiş tekniği”9, dikiş7 ve cerrahi tutkal10,11,12.

Bu çalışmanın amacı, yanık tedavisinde mevcut altın standart yaklaşımı özetleyen ve canlı olmayan doku eksizyonu ve deri greftlemesi içeren tam kalınlıkta yanık yarası bir murine modeli geliştirmektir. Önceden ısıtılmış pirinç şablon kullanılarak farenin dorsum yüzeyinde termal yanık yapıldı. Burn eschar çıkarıldı ve donör farenin kuyruğundan alınan tam kalınlıkta greft ile değiştirildi. Bu deneysel modelin üç temel avantajı vardır. İlk olarak, alıcı farenin arkasına birden fazla yanık yarası indüklenebilir ve donör farenin tek bir kuyruğundan dört donör deri grefti alınabilir. Bu, birkaç deneysel ve kontrol tedavisinin aynı alıcı ve donör hayvanlar kullanılarak karşılaştırılabilir olduğu anlamına gelir. İstenilen uygulama güzergahına bağlı olarak, kontrol tedavisi aracın veya plasebo kontrolünün lokal veya sistemik yönetimini içerebilir (örn. merhem, deri altı, intraperitoneal veya intravenöz çözelti enjeksiyonu topikal uygulama). İkinci olarak, tedavinin zamanlaması ve deneyin bitiş noktası kontrol edilebilir. Üçüncü olarak, bu model arka dan hasat deri ile karşılaştırıldığında donör siteye başarılı bir kuruluş için daha yüksek bir olasılık olduğu bilinmektedir kuyruk hasat tam kalınlıkta greftler kullanarak yaraların rekonstrüksiyonu bağlıdır13. Bu epidermal Langerhans hücrelerinin daha düşük sayıda nedeniyle olabilir, kutanöz immünobiyoloji önemli bir rol oynamaktadır, ve deri grefti reddi ile ilişkili14.

Önerilen yara iyileşmesi ve greft entegrasyonu modeli transgenik ve nakavt farelere de uygulanabilir. Genetiği değiştirilmiş farelerin kullanımı, bazı genlerin yara onarımı sırasında oynayabileceği rollerin açıklığa kavuşturulmaya yardımcı olacaktır. Topikal yara preparatlarının eksojen uygulaması veya yaralanma yerinde terapötik antikorların subkutan uygulaması da düşünülebilir.

Teknik zorluklar nedeniyle farelerde epidermisin ve dermisin bir kısmından oluşan bölünmüş kalınlıkta deri greftlerinin elde edilmesi zordur. Epidermis ve tam kalınlıkta dermisten oluşan tam kalınlıkta deri greftlerinin başarılı bir entegrasyon için iyi vaskülarize bir yara yatağı gerektirdiği bilinmektedir. Farelerde bölünmüş kalınlıkta deri greftlerinin hasat edilememesi bu modelin bir sınırlaması olarak kabul edilebilir. Alıcı yara yatağına deri greftfikasyonu doku fiksasyon diğer araçlara göre daha az travma ve hızlı bozulma ile ilişkili cerrahi yapışkan tutkal, uygulama ile elde edildi15. Önceki çalışmalar, dikiş cerrahi işlem15sonra 24 saat cerrahi tutkal daha güçlü doku fiksasyonu ile ilişkili olduğunu göstermiştir , hangi prosedürün bir dezavantajı olarak kabul edilebilir. Ancak, daha sonraki zaman noktalarında, cerrahi bir yapıştırıcı ile tedavi yaraların biyomekanik gücü dikişler karşılaştırılabilir hale gelir15 ve zımba fiksasyon daha iyi16. Cerrahi yapıştırıcı ile doku fiksasyonu sonrasında, yaralar bir yara pansuman ile kapatılmalıdır. Farenin sırt yüzeyindeki yaraların hayvana ulaşması zor olsa da, yara pansumanı, diğer taraftan, hayvanın manipüle etmesi ve çıkarması kolaydır. Sık sık yara pansuman değişiklikleri garanti edilebilir.

Küçük kemirgenlerde anesteziye bağlı hipotermi iyi belgelenmiş bir olgudur17. Hipotermi komplikasyonlara neden olan bu prosedürün bir yan etkisidir, ve potansiyel hem hayvan sağlığı ve veri kalitesi ödün. Bu nedenle, bu yöntem, özellikle tüysüz SKH1-Hrhr kullanılıyorsa, sıcaklık yönetimi stratejilerinin uygulanmasını garanti eder.

Farelerin insan yarasını kapatmayı taklit etmek için kullanılmasının en önemli sınırlaması deri anatomisi ile fizyolojiarasındaki farktır. Fare yaraları çoğunlukla kasılma ile iyileşirken, insan yaraları granülasyon dokusu oluşumu ve yeniden epitelizasyon yoluyla iyileşir18. Bu tutarsızlık için, mevcut model değiştirilebilir ve sıkıca cilt daralması önlemek için yara etrafında yapıştırılan bir splinting halkası ile birlikte kullanılabilir19. Bu in vivo protokolün bazı avantajları ve dezavantajları göz önüne alındığında, bu model in vitro çalışması imkansız yara iyileşmesi ile ilgili belirli süreçleri incelemek için bir araç olarak hizmet verebilir.

Protocol

Tüm deneyler Fransa Yüksek Öğretim ve Araştırma Bölümü tarafından onaylanmıştır (Çalışma Numarası: 122162017111616517670v2 ve DAP180012). Tüm fareler plastik kafeslere vardıklarında tek kişiliktir ve çalışmadan önce 7 günlük bir iklimlendirme süresine izin ver. Hayvan odası 12/12 saat açık/koyu çevrimde (07:00’de ışıklar açık) bakımlıydı. Gıda ve musluk suyu reklam libitum sağlanmıştır. BALB/c ve SKH1-Hrhr fareleri geleneksel buğday/soya bazlı beslenme ile beslendi. Talaşlı yatak takımları, yuvalama malzemesi ile birlikte sağlanmıştır. 1. Ekipman hazırlama İşlem için yanan bir cihaz hazırlayın ve sıcaklık kontrol cihazını kullanarak 80 °C’ye ayarlayın(Şekil 1A). Kızılötesi termal görüntüleme kamerasını kullanarak pirinç şablonunun(Şekil 1B,C)sıcaklığını doğrulayın. Dijital manometrenin doğru çalıştığından emin olun. Sahneyi cerrahi bir örtü ile kapatın ve masanın yüksekliğini ayarlayın(Şekil 1A). 2. Ameliyat öncesi ve intraoperatif hayvan bakımı 6-8 haftalık BALB/c ve SKH1-Hrhr farelerini edinin. İçme suyuna 3 mg/mL’de parasetamol süspansiyon u ekleyin ve işlemden 12 saat önce ve işlemden 72 saat sonrasına kadar tedarik edin. 1 mL şırınga ve 26 G iğne kullanarak, işlemden önce 0,05 μg/g 30 dakika ve işlemden sonraki ilk 72 saat boyunca her 6 saatte bir buprenorfini subkutan olarak uygulayın. 1 mL şırınga ve 26 G iğne kullanarak farenin dorsumuna lidokain ve yanık yarası bölgesine 2-3 mm distal uygulayın. Yanık yarasının indüksiyonundan önce 0,05 μg/g subkutan 15 dk lidokain enjekte edin. 10 mg/kg ve ketamin 100 mg/kg’da intraperitoneal ksilazin enjeksiyonu kullanarak fareleri anestezik. Enjeksiyonu uygulamak için 1 mL şırınga ve 26 G iğne kullanın. Kritik adım: Anestezili fareyi ısıtmalı bir pedin üzerine yerleştirin ve anestezinin indüksiyonundan sonra ilk 30 dakika ve anesteziden sonra en az 15 dakika hipotermiyi önlemek için fareyi sıcak tutun. Isıtılan ped ek olarak, ısı lambalarıda dahil olmak üzere diğer yöntemler , sıcak sıvı veya hava dolaşan, ve önceden ısıtılmış ısı rezervuarları vücut ısısını düzenlemek için kullanılabilir. Korneanın susuzlukunu önlemek için farenin gözlerine yağlama jeli uygulayın. Anestezi derinliğini değerlendirmek için ayak ucutu çekilme refleksini kullanın. 1 mL şırınga ve 26 G iğne kullanarak %5 dekstroz ile desteklenmiş 200 μL Lactated Ringer’s Solution uygulayın. Dehidratasyon önlemek için anestezi indüksiyon hemen sonra ve işlemden 6 saat sonra subkutan sıvı replasmanı uygulayın. 3. Tam kalınlıkta yanık yara indüksiyonu Saç makası ile uyuşturulmuş fareyi tıraş edin. Farenin dorsum yüzeyine 1 dakika boyunca depilating krem uygulayın. Bazı steril gazlı bez kullanarak krem silin ve nemli gazlı bez bir parça ile alanı temizleyin. Kuruyana kadar biraz gazlı bezle cildi lekelayın. Fareyi cerrahi bir örtüyle kaplı sahneye yerleştirin ve sahneyi önceden ısıtılmış pirinç şablonuna yukarı doğru hareket ettirin. Farenin arkasına dairesel pirinç şablonu uygulayın (20 s için 80 °C) sabit basınç kullanarak 0,15 N(Şekil 2). Kritik adım: Yanık indüksiyonundan hemen sonra, hipotermiyi önlemek ve işlem sırasında ve sonrasında fareyi sıcak tutmak için uyuşturuldu hayvanı ısıtmalı pedin üzerine yerleştirin. Anesteziden sonra fareyi kafese geri getirin. Kritik adım: Cerrahi işlemden sonra ilk 72 saat boyunca kafes zeminüzerinde püre diyet sağlayın. Fareler bazen bir yanık yarası yaralanması sonra su içmek için bir sipper tüp ulaşmak için isteksiz. 4. Donör greftinin hasadı Donör farenin kuyruğunun üst kısmında neşter ile uzunlamasına bir kesi yapın ve cerrahi forceps kullanarak yavaşça deri kaldırın. Kuyruk derisini 10 mL steril %0,9 tuzlu çözelti ile dolu steril bir Petri kabına yerleştirin. Tek tek greftleri ölçmek için bir cetvel kullanın ve kuyruk derisini her biri 15 mm ölçülerinde, neşter kullanarak parçalara ayırın. Hazırlandıktan sonra deri greftlerini 4 °C’de %0,9 tuzlu çözeltide 2 saate kadar saklayın. 5. Cerrahi eksizyon ve deri greftleme Yanık indüksiyonundan 24 saat sonra fareyi isoflurane inhalasyonu ile anesteziye hazırlayın. Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve 0 oksijende %5 izofluran kullanarak 4 L/dk akış hızında anestezi yetirin. Ameliyat sırasında anesteziyi sürdürmek için 2 L/dk’da %2 isofluran kullanın. Fare üzerine bir cerrahi perde yerleştirin ve cerrahi alanı ortaya çıkarmak için bir pencere kesip. Aseptik tekniği kullanarak, yarayı önce povison-iyot, sonra alkolle temizler. Yavaşça cerrahi cımbız bir çift ile yanmış doku almak ve steril cerrahi makas ve cımbız ile tüm nekrotik ve cansız doku çıkarmak. Kararlı bir alıcı yatak oluşturmak için hipodermis panniculus carnosus tabakası çıkarın. Deri greftini taze hazırlanmış yara yatağına yerleştirin. Cerrahi cımbızkullanarak çevredeki deriyi deri greftine doğru yavaşça çekin. Grefti yara yatağına takmak için bazı cerrahi yapıştırıcıuygulayın ve cilt kenarlarını hizalamak için hafifçe bastırın. Kritik adım: Başarılı engraftment sağlamak için yara yatağının boyutu deri greft boyutundan biraz daha büyük olmalıdır. Farenin anesteziden kurtulmasına izin verin. Kritik adım: Fareyi ısıtmalı bir pedüzerine yerleştirin. Hipotermiyi önlemek için işlem sırasında ve sonrasında fareyi sıcak tutun. Aşılı yara nın üzerine inert parafin gazlı bez pansuman ve yapışkan ikincil pansuman uygulayın. Fareyi ayrı bir kafese yerleştirin. Kritik adım: Cerrahi işlemden sonraki ilk 72 saat boyunca kafes zemininde püre diyeti sağlayın ve her gün izleyin. Oyuncaklar sağlayın ve çevreyi zenginleştirin. 6. Dijital görüntüleme ve post-mortem yara toplama Yaranın yanına cetvel yerleştirerek dijital kamera ile fotoğraf yaraları(Şekil 3). Deneyin son noktasında, karbondioksit ve servikal çıkış maruz kalma tarafından hayvanların ötenazi. Kritik adım: Servikal çıkığı sırasında derinin aşırı çekme hareketi grefte zarar verebilir. Post-mortem, cerrahi makas kullanarak fasya dorsal yanık yaraları çıkarmak. İki sect yaralar. Histoloji ve immünohistokimya için ‘luk tamponlu formalin ve proseste yarısını düzeltin. RNA ekstraksiyonu ve protein niceliği için diğer yarısını sıvı nitrojende hızlı bir şekilde dondurun ve -80 °C’de tutun. 7. Deri histolojisi, immünohistokimya ve kollajen görselleştirme Deri örneklerini parafinin içine yerleştirin, 4 μm kesitlere bölün ve pozitif yüklü slaytlara yerleştirin. Re-epitelizasyon oranını (%orijinal yaranın) değerlendirmek için hematoksilin ve eozin ile boyanmış slaytlar kullanın. Neo-epidermis ile kaplı yaranın alanı tüm yaranın yüzdesi olarak ifade edilebilir(Şekil 4). Bölümlerin mikroskobik analizini yapmak için dijital mikroskop uygulamasını ve ImageJ yazılımını kullanın. Formalin-sabit ve parafin gömülü dokudan hazırlanan histolojik kesitleri (4 μm kalınlıkta) kullanın ve immünohistokimyaya tabi tetkikler. Yaralarda kollajen I ve fibronektin ekspresyonunu değerlendirmek için, primer antikorlar uygulayın ve 1 saat boyunca inkübat. Ya ile tepki bölümleri: (i) HRP,3,3’-diaminobenziddine (DAB) veya (ii) AP, Bond Polimer Rafine Kırmızı (Malzeme Tablosu), parlak kırmızı renk verir(Şekil 5). Bir alet kullanarak bölümleri tarayın ve dijital mikroskop uygulaması ve ImageJ ile analiz edin. Kollajen birikiminin histolojik değerlendirmesini sağlamak için, ticari bir kit kullanarak histolojik kesitler üzerinde trikrom boyama yapın. Kollajen lif görüntüleme için multifoton mikroskopi ve ikinci harmonik üretim tekniğini kullanın(Şekil 5). Daha önce açıklandığı gibi doku görüntüleme için bir multifoton mikroskop kullanın20. İkinci harmonik ve iki fotonlu heyecanlı floresan sinyalleri (TPEF) oluşturmak için lazer kaynağı olarak 810 nm merkezi dalga boyuna sahip bir Ti:Safir lazer kullanın. İkinci harmonik nesil (SHG) ve TPEF’i toplamak ve heyecanlandırmak için 25x/0.95 W hedefine sahip bir lazer ışını kullanın. NDD PMT dedektörleri tarafından daha önce21 olarak açıklanan sinyalleri algıla. Lazer tarama kontrolü ve görüntü edinimi için yazılım kullanın.

Representative Results

Sonuçlar, geliştirilen protokolün farelerde tam kalınlıkta yanık yarası indüksiyonuna izin veren basit bir yöntem olduğunu göstermektedir. Yanıklar önceden ısıtılmış pirinç şablonu kullanılarak indüklenir (Şekil 1A-C). Yanmış alan beyaz eschar ve hiperemik bölge ile dairesel bir yara olarak görünür. Yanık yarası boyutu biraz daha büyük 24 saat sonra yanık yaralanması iyi tanımlanmış fenomen inflamasyon22nedeniyle bilinen yanık yaralanması ilerlemesi olarak bilinen bir sonucu olarak. Eksizyondan sonra yanık yaraları allojenik deri grefti kullanılarak yeniden oluşturulur (Şekil 3). 7. gün yanık yaralanmasından sonra5yaralar vaskülarize 5 olur ve bu da başarılı bir engreftlemenin göstergesidir. Epidermal keratinositler yarayı kapatmak ve yaraların iki kenarı arasındaki boşluğu köprülemek için bitişik alıcı deriden göç. Yaraların H ve E lekeli bölümünün mikroskobik analizi, yanık yaralanmasından sonra 7.Figure 4B Büyük bir çalışma gerçekleştirmeden önce, araştırmacıların yeni bir müdahalenin araştırılmasını, fizibilitenin değerlendirilmesini, tekrarlanabilirliği sağlamak için yöntemde modifikasyonların belirlenmesini sağlayan bir pilot çalışmayı tamamlamaları önemle tavsiye edilir. İstatistiksel olarak anlamlı etkileri küçük örneklerde tespit etmek zordur, oysa örnek boyutunu artırmak bir testin istatistiksel gücünü artırmanın bir yoludur. Örneğin, gruplar arasındaki yara yeniden epitelizasyon(Şekil 4)oranında istatistiksel olarak anlamlı bir fark (p < 0.05) saptanabilmek için, örneklem büyüklüğü grup başına altı ile sekiz fare arasında olmalıdır. Tüm deneyler en az iki kez tekrarlanmalıdır. Fibroblastlar gibi matris üreten hücreler, alıcı dokudan grefte geçerken, kollajen I ve fibronektin de dahil olmak üzere hücre dışı matriksin temel bileşenleri yeni oluşan matriste yüksek oranda ifade edilir(Şekil 5). Şekil 1: Aygıt kurulumu nun yakılması. (A) Yanan cihazın yerleştirilmesi ve kurulumu. Yanan cihaz sıcaklık kontrol cihazına bağlıdır ve basıncın izlenmesini sağlamak için dijital monometreye bağlıdır. Yanan cihaz ayarlanabilir bir sahne üzerinde asılı – fareler yanık indüksiyon için yerleştirilir üzerine düz yüzey. (B-C) Yara yanıklarını tetiklemek için kullanılan pirinç şablonunun yakın çekim görüntüsü. (C) Pirinç şablonunun çapı 1 cm’dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2: Bu makalede açıklanan deneysel modeli yeniden oluşturmak için gereken farklı adımlarışematik illüstrasyon. Prosedürün üç ana adımı vardır: (i) önceden ısıtılmış pirinç şablonu kullanarak yanık yaranın indüksiyonu; (ii) yanık yaralanmasından 24 saat sonra canlı olmayan nekrotik dokunun cerrahi eksizyonu; (iii) donör fareden alınan tam kalınlıktaki allojenik deri grefti kullanılarak cerrahi yara rekonstrüksiyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Yeniden inşa edilmiş fare yanık yaralarının makroskopik görünümü. Yanık yaralanması sonrası 0, 1, 3 ve 7 gün allojenik deri greftleri ile yeniden yapılandırılalı yanık yaralarının temsili dijital görüntüleri. Görüntülerdeki cetvel milimetre cinsinden. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: Yanık yaralanmasından 3 ve 7 gün sonra yaraların mikroskobik görünümü. Yaraların H&E-lekeli bölümleri 3 ve 7 gün yanık yaralanmasından sonra. Neo-epidermis uzunluğu (noktalı çizgi) anlamlı olarak artar (A) gün 3 yaralar ile karşılaştırıldığında (B) gün 7 yaralar. (A) ve (B), ölçek çubuğu 100 μm. (C) Yara nın yeniden epitelizasyon yüzdesinin grafik gösterimidir. Bu durum, 3. Sonuçlar ortalama ± S.E.M. (n = 6 fare gün 3 grupta; n = 6 fare gün 7 grupta, *p < 0.05; Öğrencinin t-testi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: Hücre dışı matriks ve kollajen I görselleştirmesinin değerlendirilmesi. 7. gün fare yaraları için boyanmış immünohistokimya analizinin temsili görüntüleri (A) kollajen ve (B) fibronektin. Uzamış mil şeklindeki kollajen I-pozitif hücrelerde yoğun kırmızı boyama unutmayın. 7. gün yaralarının dermisinde fibronektin pozitif hücrelerde kahverengi boyama dikkat edin. Ölçek çubuğu = Tüm görüntülerde 50 μm. In (A) ve (B), e epidermis ve d dermis ifade eder. (C) Kollajen liflerinin görüntülenmesi ve kollajen birikiminin histolojik değerlendirilmesi. (D) Temsilci TPEF/SHG kollajen görüntü gün 7 fare yaraları. Dairesel polarizasyon ve SHG sinyalleri kullanılarak eşzamanlı TPEF/SHG edinimi, bir eşik uygulandıktan sonra SHG’nin ikili dağılımını elde etmek için seçici olarak işlenmiştir. TPEF görüntüleri (yeşil) ve SHG görüntüleri (beyaz) sözde renkli ve overlaid edildi. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Yanık yaralanması kalınlık sınıflandırmasına göre23, tam kalınlıkyanıkları derinin tüm kalınlığı ve deri altı dokunun belirli bir bölümünün belirgin tutulumu ile karakterizedir. Bu tip yaralar sadece kasılma veya deri greftleme ile iyileşebilir2. Bu makalede açıklanan yöntemin doğal bir sınırlama sadece tam kalınlıkta greftler, genellikle klinik ortamda kullanılan bölünmüş kalınlık greftler aksine, bir fare kuyruğundan hasat olmasıdır. Bu teknik zorluk nedeniyle, fare derisi bölünmüş kalınlıkta greft elde etmek için çok ince olduğu gibi oldu. Bu tam kalınlıkta greftler iyi vaskülarize yara yatağı gerektirir dikkat edilmelidir, bölünmüş kalınlıkta deri greftleri daha az vaskülarite ile donör sitelerinde hayatta edebiliyoruz ise24. Önceki çalışmalar farenin arkasına indüklenen bir yanık yarası yeni vaskülatür sağlam bir oluşumu ile ilişkili olduğunu gösterdi5. Bu iyi vaskülarize alan, farenin dorsum gibi, yanık yaralarının indüksiyon için anatomik dönüm noktası olarak kabul edilebilir düşündürmektedir.

Yanık yara derinliği dikkate alınması gereken önemli bir faktördür. Yanık yarası derinliği tek tek fareler arasında tutarlı olmalıdır. Yanık yarası derinliğinin tekrarlanabilirliği pirinç şablonunun sıcaklığına, basınca ve ısıya maruz kalma süresine bağlıdır. Yanık yarası derinliği histolojik olarak doğrulanmalıdır. Bu aşırı basınç veya önceden ısıtılmış pirinç şablona cildin uzun süreli maruz kalma altta yatan doku zarar verebilir akılda tutmak önemlidir. Merkezi ve periferik sinir sisteminin bileşenleri de dahil olmak üzere vertebral kolon çevreleyen doku, ısıya duyarlı, ve hasarlı ise arka bacak felce neden olabilir.

Ameliyat sonrası mortalite cerrahi işlemle doğrudan ilişkili olmamasına rağmen, özellikle soğuğa duyarlı olan az sayıda tüysüz SKH1-Hrhr faresi hipotermi gelişmiş ve genel anestezi den sonra iyileşememiştir. Bu nedenle tüm estetik olaylar sırasında ek ısı sağlanmalı ve fare uyuşturulurken sürekli gözetim gereklidir.

Bu çalışmada açıklanan yöntem cerrahi alan enfeksiyonu ile ilişkili değildi. Ancak perioperatif dönemde mikroorganizmaların cerrahi yaraya transferini önlemek için aseptik teknik kullanılmalıdır. Yaranın biyolüminesans veya floresan mikroorganizmalarla aşılanması prosedüre dahil edilebilir. Bu teknik enfeksiyöz organizmaların ve patogenezlerinin incelenmesinde yararlı olabilir25. Örneğin, biyolüminesans bakterilerin eksojen eklenmesi veya enjeksiyonu, in vivo bütün hayvan görüntüleme25kullanarak mikrobiyal yükün izlenmesine izin verebilir. Fare saç in vivo tüm hayvan floresan ve biyolüminesans görüntüleme müdahale bilinmektedir göz önüne alındığında, tüysüz SKH1-Hrhr fareler floresan veya biyolüminesans muhabirleri içeren çalışmalar için ideal ev sahipliği yapmaktadır.

Yara dokusu örnekleri farklı zaman noktalarında toplanabilir ve histolojik ve immünohistokimyasal analiziçin işlenebilir. Protein ve RNA deri biyopsisinden izole edilebilir ve yara iyileşmesinde rol oynayan anahtar moleküllerin ekspresyonunu değerlendirmek için moleküler biyoloji teknikleri kullanılabilir.

Bu çalışmada yanık yara iyileşmesi ve allojenik deri engraftment deneysel bir model açıklanmıştır. Bu prosedür değiştirilebilir ve klinik öncesi çalışmalar için bir model olarak hizmet vermektedir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma La Direction Générale de L’Armement, l’Agence de l’Innovation de Défense ve École Polytechnique tarafından desteklenmiştir. Video dosyasının üretimine büyük ölçüde yardımcı olan içgörü ve uzmanlık sağlayan École Polytechnique’den meslektaşımız Bay Yann Plantier’e teşekkür ederiz. Yazarlar INSERM Lavoisier (SEIVIL) US 33, Hôpital Paul Brousse, Villejuif kendi hayvan refahı ve bakım uzmanlık bu proje sırasında sağlanan için Bay Benoit Peuteman ve Bayan Charlotte Auriau teşekkür ederiz.

Materials

1 ml syringue Terumo SS + 01T1
26 G needle Terumo Agani NN-2613R 1/2'' – 0,45 X 12mm
96X21 mm Petri Dish Dutscher 193199
Animal Weighing scale Kern EMB 5.2K5
BALB/c mouse Janvier labs BALB/cAnNRj 6-weeks old
Biopsy foam pads 30.2X25.4X2mm Simport M476-1
Bond polymer Refine Red Leica Biosystems DS9390
Brass block BVG custom-designed Circular 10 mm in diameter
Buprenorphine (BUPRECARE) Axience FR/V/6328396 3/2011 administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g
Burning apparatus Kausistar 400 TraçaMatrix 34010
CaseViewer 3DHISTECH Ltd. 3Dhistech, Budapest, Hungary
Collagen I antibody Abcam ab34710 Recommanded concentration 1:50; 1:200
D-(+)- glucose (Dextrose) Sigma Aldrich G-8769-100 ml
DAB Leica Biosystems AR9432
Digital camera NIKON D3400 objective: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45
Depilating cream Veet
Disposable scalpels Swann Morton 6601
DPBS PAN biotech P04-36300
Ethanol absolute VWR chemicals 20821.310
Fibronectin antibody Abcam ab23750 Recommanded dilution 1:1000
Filter 0.22um Sartorius 16532
Fine Scissors F.S.T. 14094-11
Forceps Dumont F.S.T. 11295-10
Hair clippers AESCULAP B00VAQ4KUY (ISIS)
Heating pad Petelevage 120070
Isofluorane Piramal healthcare FR/V/03248850/2011
Ketamine Imalgene FR/V/0167433 4/1992 surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 100mg/kg
Lactated Ringers solution Flee-Flex 1506443
Lamina multilabel slide scanner Perkin Elmer
LAS software Leica version 2.7.3
Leica Bond III Leica Biosystem 1757
Leukosilk dressing BSN medical 72669-01
Lidocaine Aguettant N01BB02 local analgesic, administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g
Manometer Kern HDB-5K5
Masson Trichrome Staining kit Sigma-Aldrich HT15-1KT
Micromesh Biopsy cassettes Simport M507
Multiphoton inverted stand Leica SP5 microscope Leica microsystems DM500 Scanner 8000Hz NDD PMT detectors
Non adhering dressing Adaptic Systagenix A6222 12.7cm X 22.9 cm
Ocrygel Tvm France ###
Paracetamol 300mg Dolliprane Liquiz
Paraformaldheyde 4% VWR chemicals 1169945
Povidone-iodine MEDA pharma D08AG02 diluted to 1:2
SKH1-Hrhr mouse Charles river 686SKH1-HR 6-weeks old
Slides Thermoscientific AGAA000080
Surgical adhesive BSN medical 9927
Sterile Gauze Hartmann 418545/9 10 X 10 cm
Sterile water Versylene Fresenius B230521
Surgical drape Hartmann 2775161
Ti:Sapphire ChameleonUltra Coherent DS 16-02-16 F 690-1040 nm
Thermal imaging Camera Testo Testo 868
Xylazine (Rompum 2%) Bayer FR/V/ 8146715 2/1980 surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shakir, S., et al. Indications and Limitations of Bilayer Wound Matrix-Based Lower Extremity Reconstruction: A Multidisciplinary Case-Control Study of 191 Wounds. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2019).
  2. Greenhalgh, D. G. Management of Burns. New England Journal of Medicine. 380 (24), 2349-2359 (2019).
  3. Bosse, M. J., et al. An analysis of outcomes of reconstruction or amputation after leg-threatening injuries. New England Journal of Medicine. 347 (24), 1924-1931 (2002).
  4. Braza, M. E., Fahrenkopf, M. P. . StatPearls. , (2019).
  5. Duchesne, C., Banzet, S., Lataillade, J. J., Rousseau, A., Frescaline, N. Cold atmospheric plasma modulates endothelial nitric oxide synthase signalling and enhances burn wound neovascularisation. Journal of Pathology. 249 (3), 368-380 (2019).
  6. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), 266 (2014).
  7. Pakyari, M., et al. Local Expression of Indoleamine 2,3, Dioxygenase Prolongs Allogenic Skin Graft Take in a Mouse Model. Advances in Wound Care. 8 (2), 58-70 (2019).
  8. Pakyari, M., et al. A new method for skin grafting in murine model. Wound Repair and Regeneration. 24 (4), 695-704 (2016).
  9. McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Current Protocols in Immunology. , (2009).
  10. Cristobal, L., et al. Local Growth Hormone Therapy for Pressure Ulcer Healing on a Human Skin Mouse Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), (2019).
  11. Melican, K., Aubey, F., Dumenil, G. Humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
  12. Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
  13. Larsen, C. P., et al. Migration and maturation of Langerhans cells in skin transplants and explants. Journal of Experimental Medicine. 172 (5), 1483-1493 (1990).
  14. Leonard, D. A., Kurtz, J. M., Cetrulo, C. L. Vascularized composite allotransplantation: towards tolerance and the importance of skin-specific immunobiology. Current Opinion in Organ Transplantationt. 18 (6), 645-651 (2013).
  15. Stoikes, N., et al. Biomechanical evaluation of fixation properties of fibrin glue for ventral incisional hernia repair. Hernia: The Journal of Hernias and Abdominal Wall Surgery. 19 (1), 161-166 (2015).
  16. Foster, K., et al. Efficacy and safety of a fibrin sealant for adherence of autologous skin grafts to burn wounds: results of a phase 3 clinical study. Journal of Burn Care & Research. 29 (2), 293-303 (2008).
  17. Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (5), 577-583 (2013).
  18. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models of Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
  19. Wang, X., Ge, J., Tredget, E. E., Wu, Y. The mouse excisional wound splinting model, including applications for stem cell transplantation. Nature Protocols. 8 (2), 302-309 (2013).
  20. Ruzehaji, N., et al. Pan PPAR agonist IVA337 is effective in prevention and treatment of experimental skin fibrosis. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (12), 2175-2183 (2016).
  21. Ruzehaji, N., et al. Combined effect of genetic background and gender in a mouse model of bleomycin-induced skin fibrosis. Arthritis Research & Therapy. 17, 145 (2015).
  22. Singer, A. J., Burn Boyce, S. T. Wound Healing and Tissue Engineering. Journal of Burn Care & Research. 38 (3), 605-613 (2017).
  23. Shakespeare, P. Burn wound healing and skin substitutes. Burns. 27 (5), 517-522 (2001).
  24. Sun, B. K., Siprashvili, Z., Khavari, P. A. Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds. Science. 346 (6212), 941-945 (2014).
  25. Miller, R. J., et al. Development of a Staphylococcus aureus reporter strain with click beetle red luciferase for enhanced in vivo imaging of experimental bacteremia and mixed infections. Scientific Reports. 9 (1), 16663 (2019).

Tags

Murine ModelBurn WoundAllogeneic Skin GraftFull Thickness BurnSkin GraftThermal Burn Injury DeviceEpidermisDermisSubcutaneous FatSuperficial BurnsPartial Thickness BurnsFull Thickness BurnsSkin GraftingDonor MouseRecipient MouseInbred StrainHairless MiceWound HealingInfectionBacterial GrowthThermal Imaging Camera

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Blaise, O., Duchesne, C., Banzet, S., Rousseau, A., Frescaline, N. A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft. J. Vis. Exp. (162), e61339, doi:10.3791/61339 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image