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Um modelo murino de uma ferida de queimadura reconstruída com um enxerto de pele aogenética

Published: August 08, 2020
doi:
10.3791/61339
, , , ,
1Laboratoire de Physique des Plasmas, École Polytechnique,Sorbonne Université, CNRS, 2Institut de Recherche Biomédicale des Armées, Clamart,INSERM UMRS-MD

Summary

O objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo murino de cicatrização de feridas queimadas. Uma queimadura térmica foi induzida na pele dorsal de camundongos usando um modelo de latão pré-aquecido. Tecido queimado foi desbridado e sobreposto com um enxerto de pele colhido da cauda de um rato doador geneticamente semelhante.

Abstract

Feridas superficiais triviais curam sem complicações por intenção primária. Feridas profundas, como queimaduras de espessura total, cicatrizam por intenção secundária e requerem desbridamento cirúrgico e enxerto de pele. A integração bem sucedida do enxerto de doador em um leito de ferida do receptor depende do recrutamento oportuno de células imunes, resposta angiogênica robusta e nova formação de matriz extracelular. O desenvolvimento de novos agentes terapêuticos, que visam alguns processos-chave envolvidos na cicatrização de feridas, são dificultados pela falta de modelos pré-clínicos confiáveis com avaliação objetiva otimizada do fechamento da ferida. Aqui, descrevemos um modelo barato e reprodutível de ferida experimental de queimadura de espessura total reconstruída com um enxerto de pele aogenérica. A ferida é induzida na superfície dorsum de camundongos do tipo selvagem de raça anesthetizada dos fundos BALB/C e SKH1-Hrhr. A queimadura é produzida usando um modelo de latão medindo 10 mm de diâmetro, que é pré-aquecido a 80 °C e entregue a uma pressão constante para 20 s. Burn eschar é extirpado 24 horas após a lesão e substituído por um enxerto de espessura total colhido da cauda de um rato doador geneticamente semelhante. Não é necessário equipamento especializado para o procedimento e as técnicas cirúrgicas são simples de seguir. O método pode ser implementado sem esforço e reproduzido na maioria dos ambientes de pesquisa. Certas limitações estão associadas ao modelo. Devido a dificuldades técnicas, a colheita de enxertos de pele de espessura dividida mais fina não é possível. O método cirúrgico que descrevemos aqui permite a reconstrução de feridas de queimadura usando enxertos de pele de espessura total. Pode ser usado para realizar testes terapêuticos pré-clínicos.

Introduction

Debridamento cirúrgico e enxerto de pele são práticas clínicas comuns utilizadas no manejo de feridas crônicas1, queimaduras2e feridas agudas como feridas traumáticas3. O enxerto de pele refere-se ao procedimento cirúrgico, que envolve a remoção da pele saudável de uma parte do corpo e a transferência para outra. Os enxertos de doadores substituem o tecido perdido e fornecem um andaime estrutural para migração e crescimento celular. Após a integração no local do receptor, os enxertos de pele substituem a barreira da pele perdida, proporcionando proteção contra invasão microbiana, efeitos nocivos do ambiente externo e perda excessiva de umidade4. A integração bem sucedida do enxerto de pele depende de vários fatores. Estes incluem respostas imunes adequadas na presença de infecções microbianas e resolução oportuna de inflamação, angiogênese robusta no local da ferida e estabelecimento de anastomoses vasculares entre o leito receptor e o enxerto do doador5. À medida que o enxerto começa a se degradar, as células dérmicas residentes devem ser substituídas por células capazes de produzir uma nova matriz extracelular. Ao mesmo tempo, os queratinócitos epidérmicos devem rastejar sobre a matriz recém-produzida para formar a neo-epiderme e re-epitelializar a ferida. É evidente, portanto, que a migração eficiente das células do leito receptor para o enxerto do doador é outro fator determinante que influencia a incorporação bem sucedida do enxerto. Dado o grande número de fatores envolvidos na cicatrização de feridas6, o que pode ser impossível de controlar nos ensaios em humanos devido a limitações éticas, são necessários modelos de enxerto experimental pré-clínico da pele. O desenvolvimento de modelos pré-clínicos de cicatrização de feridas queimadas e enxerto de pele associado será importante para a compreensão de mecanismos complexos envolvidos na reparação de tecidos cutâneos e essenciais para o teste de novos agentes terapêuticos. Os modelos in vitro de cicatrização de feridas são incapazes de imitar com precisão a complexidade do tecido cutâneo. Os modelos in vivo animal são uma ferramenta investigativa indispensável na compreensão dos mecanismos envolvidos na reparação de tecidos.

Vários métodos de técnica de enxerto de pele foram desenvolvidos em roedores para imitar a excisão cirúrgica e a reconstrução da ferida de queimadura7,,8,9. No entanto, a maioria dos procedimentos descritos anteriormente não induziu uma lesão térmica antes do enxerto de pele. Em vez da ferida queimada, uma ferida excisional de espessura total foi induzida, que foi então reconstruída com uma alusão de pele de espessura total7. Vários marcos anatômicos como a orelha, cauda e costas têm sido utilizados para a colheita da pele do doador em roedores7,8. Foram relatadas diferentes técnicas de fixação e estabilização do enxerto, incluindo uma “técnica de sutura”9,suturas7 e cola cirúrgica10,,11,12.

O objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo murino de uma ferida de queimadura de espessura total que recapitulasse a abordagem padrão-ouro atual no tratamento de queimaduras, que envolve excisão tecidual inviável e enxerto de pele. Uma queimadura térmica foi induzida na superfície dorsum de um rato usando um modelo de latão pré-aquecido. Burn eschar foi extirpado e substituído por um enxerto de espessura total colhido da cauda de um rato doador. Há três vantagens fundamentais para este modelo experimental. Primeiro, mais de uma ferida de queimadura pode ser induzida na parte de trás do rato receptor, e quatro enxertos de pele doadores podem ser colhidos de uma única cauda do rato doador. Isso significa que vários tratamentos experimentais e de controle podem potencialmente ser comparados usando o mesmo receptor e animais doadores. Dependendo da rota desejada de administração, o tratamento de controle pode incluir administração local ou sistêmica do controle do veículo ou placebo (por exemplo, aplicação tópica de pomada, subcutânea, injeção intraperitoneal ou intravenosa de solução). Segundo, o tempo do tratamento e o ponto final do experimento podem ser controlados. Em terceiro lugar, este modelo depende da reconstrução de feridas utilizando enxertos de espessura total colhidos da cauda, que são conhecidos por terem maior probabilidade de incorporação bem sucedida no local do doador em comparação com a pele colhida na parte de trás13. Isso pode ser devido ao menor número de células langerhans epidérmicas, que desempenham um papel fundamental na imunobiologia cutânea, e estão associadas à rejeição do enxerto de pele14.

O modelo proposto de cura de feridas e integração de enxertos pode muito bem ser aplicado a camundongos transgênicos e eliminatórios. O uso de camundongos geneticamente modificados ajudará a elucidar os papéis que certos genes podem desempenhar durante o reparo da ferida. Também pode ser considerada a aplicação exógena de preparações de feridas tópicas ou administração subcutânea de anticorpos terapêuticos no local da lesão.

Devido a dificuldades técnicas, enxertos de pele de espessura dividida constituídas pela epiderme e parte da derme são difíceis de obter em camundongos. Enxertos de pele de espessura total constituídos pela epiderme e derme de espessura total são conhecidos por exigir um leito de ferida bem vascularizado para uma integração bem sucedida. A incapacidade de colher enxertos de pele de espessura dividida em camundongos pode ser considerada como uma limitação deste modelo. A fixação do enxerto de pele no leito da ferida receptora foi obtida através da aplicação da cola adesiva cirúrgica, que está associada a menos trauma e degradação rápida em comparação com outros meios de fixação tecidual15. Estudos anteriores mostraram que a sutura está associada a uma fixação tecidual mais forte do que a cola cirúrgica às 24h após o procedimento cirúrgico15, o que pode ser considerado como desvantagem do procedimento. No entanto, em momentos posteriores, a força biomecânica das feridas tratadas com um adesivo cirúrgico torna-se comparável às suturas15 e melhor do que a fixação do grampo16. Após a fixação tecidual com a cola cirúrgica, as feridas devem ser cobertas com um curativo da ferida. Embora as feridas na superfície dorsal do camundongo sejam difíceis de alcançar o animal, o curativo da ferida, por outro lado, é fácil para o animal manipular e remover. Alterações frequentes de curativos podem ser justificadas.

Hipotermia induzida pela anestesia em pequenos roedores é um fenômeno bem documentado17. A hipotermia é um efeito colateral desse procedimento, que causa complicações, e potencialmente compromete a saúde animal e a qualidade dos dados. Portanto, este método garante a implementação de estratégias de gestão de temperatura, especialmente se forem utilizadas skh1-hrhr sem cabelo.

A limitação mais significativa do uso de camundongos para imitar o fechamento de feridas humanas é a diferença entre a anatomia da pele e a fisiologia. As feridas do rato curam principalmente por contração, enquanto as feridas humanas cicatrizam através da formação de tecido de granulação e re-epitelialização18. Para explicar essa discrepância, o modelo atual pode ser modificado e usado em combinação com um anel de tala firmemente aderido ao redor da ferida para evitar a contração da pele19. Dadas algumas vantagens e desvantagens desse protocolo in vivo, esse modelo poderia servir como uma ferramenta para estudar certos processos envolvidos na cicatrização de feridas que são impossíveis de estudar in vitro.

Protocol

Todos os experimentos foram aprovados pelo Departamento de Ensino Superior e Pesquisa da França (Número de Estudo: 122162017111616517670v2 e DAP180012). Todos os camundongos foram alojados sozinhos na chegada em gaiolas plásticas e foram permitidos um período de aclimatação de 7 dias antes do estudo. A sala dos animais foi mantida em um ciclo claro/escuro de 12/12 h (luzes acesas às 07:00). Comida e água da torneira foram fornecidos ad libitum. Os camundongos BALB/c e SKH1-Hrhr foram alimentados com dieta tradicional à base de trigo/soja. A cama de serragem foi fornecida juntamente com material de aninhamento. 1. Preparação do equipamento Prepare um dispositivo de queima para o procedimento e coloque-o a 80 °C usando o controlador de temperatura(Figura 1A). Verifique a temperatura do modelo de latão(Figura 1B,C) usando a câmera de imagem térmica infravermelha. Certifique-se de que o manômetro digital está funcionando corretamente. Cubra o palco com uma cortina cirúrgica e ajuste a altura da mesa(Figura 1A). 2. Cuidados com animais pré-operatórios e intra-operacionais Adquira ratos BALB/c e SKH1-Hrhr, 6-8 semanas de idade. Adicione a suspensão do paracetamol a 3 mg/mL à água potável e forneça 12 horas antes e até 72 horas após o procedimento. Utilizando uma seringa de 1 mL e uma agulha de 26 G, administre buprenorfina subcutâneamente a 0,05 μg/g 30 min antes do procedimento e a cada 6 horas para as primeiras 72 horas após o procedimento. Usando uma seringa de 1 mL e uma agulha de 26 G, administre lidocaína no dorso do rato e 2-3 mm distal na área da ferida queimada. Injete lidocaína a 0,05 μg/g subcutânea 15 min antes da indução da ferida queimada. Anesthetize camundongos usando uma injeção intraperitoneal de xilazina a 10 mg/kg e cetamina 100 mg/kg. Use uma seringa de 1 mL e uma agulha de 26 G para administrar a injeção. Passo crítico: Coloque o rato anestesiado em uma almofada aquecida e mantenha o mouse aquecido para evitar hipotermia durante os primeiros 30 minutos após a indução da anestesia e por pelo menos 15 minutos após a recuperação da anestesia. Além da almofada aquecida, outras modalidades, incluindo lâmpadas de calor, líquidos quentes circulantes ou ar, e reservatórios de calor pré-aquecidos podem ser usados para regular a temperatura corporal. Aplique gel de lubrificação nos olhos do camundongo para evitar a desidratação da córnea. Use o reflexo de retirada do dedo do dedo do dedo do dedo para avaliar a profundidade da anestesia. Utilizando uma seringa de 1 mL e uma agulha de 26 G, administre 200 μL de Solução de Anel Lactado suplementada com 5% de dextrose. Administre a substituição do fluido subcutânea imediatamente após a indução da anestesia e 6 horas após o procedimento para evitar a desidratação. 3. Indução total da ferida de queimadura de espessura Raspe o rato anestesiado com os cortadores de cabelo. Aplique creme depilação na superfície dorsum do mouse por 1 minuto. Limpe o creme usando uma gaze estéril e limpe a área com um pedaço de gaze úmida. Borrique a pele com alguma gaze até secar. Coloque o mouse no palco coberto com uma cortina cirúrgica e mova o palco para cima mais perto do modelo de latão pré-aquecido. Aplique o modelo de latão circular na parte de trás do mouse (80 °C para 20 s) usando pressão constante de 0,15 N(Figura 2). Passo crítico: Imediatamente após a indução da queimadura, coloque o animal anestesiado na almofada aquecida para evitar hipotermia e mantenha o rato aquecido durante e após o procedimento. Uma vez recuperado da anestesia, devolva o rato para a gaiola. Passo crítico: Forneça uma dieta amassada no chão da gaiola durante as primeiras 72 horas após o procedimento cirúrgico. Ratos às vezes relutam em chegar a um tubo de sipper para beber água depois de uma lesão na ferida queimada. 4. Colheita do enxerto de doador Faça uma incisão longitudinal com um bisturi na parte superior da cauda do rato doador e remova suavemente a pele usando fórceps cirúrgicos. Coloque a pele da cauda em uma placa de Petri estéril cheia com 10 mL de solução salina estéril de 0,9%. Use uma régua para medir enxertos individuais e corte a pele da cauda em pedaços, cada um medindo 15 mm, usando um bisturi. Uma vez preparado, mantenha os enxertos de pele em solução salina de 0,9% a 4 °C por até 2 horas. 5. Excisão cirúrgica e enxerto de pele Vinte e quatro horas após a indução da queimadura, prepare o rato para anestesia por inalação de isoflurano. Coloque o rato na câmara de indução e induza a anestesia usando 5% de isoflurane em 100% de oxigênio a uma taxa de fluxo de 4 L/min. Para manter a anestesia durante a cirurgia, use 2% de isoflurano a 2 L/min. Coloque uma cortina cirúrgica no mouse e corte uma janela para expor o campo cirúrgico. Usando a técnica asséptica, cotonete a ferida primeiro com povidone-iodo e depois com 70% de álcool. Pegue suavemente o tecido queimado com um par de pinças cirúrgicas e extirda todo o tecido necrosado e inviável com tesouras cirúrgicas estéreis e pinças. Remova a camada panniculus carnosus da hipodermes para criar uma cama receptora estável. Coloque o enxerto de pele na cama de ferida recém-preparada. Puxe suavemente a pele circundante em direção ao enxerto de pele usando pinças cirúrgicas. Aplique algum adesivo cirúrgico para fixar o enxerto na cama da ferida e pressione suavemente para alinhar as bordas da pele. Passo crítico: O tamanho do leito da ferida deve ser ligeiramente maior do que o tamanho do enxerto de pele para garantir o enxerto bem sucedido. Permita que o rato se recupere da anestesia. Passo crítico: Coloque o mouse em uma almofada aquecida. Mantenha o rato aquecido durante e após o procedimento para evitar hipotermia. Aplique o curativo de gaze de parafina inerte e o curativo secundário adesivo sobre a ferida enxertado. Coloque o rato em uma gaiola individual. Passo crítico: Forneça alguma dieta de purê no chão da gaiola durante as primeiras 72 horas após o procedimento cirúrgico e monitore diariamente. Forneça brinquedos e enriqueça o meio ambiente. 6. Imagem digital e coleta de feridas post-mortem Fotografar feridas com uma câmera digital colocando uma régua ao lado da ferida(Figura 3). No ponto final do experimento, eutanize os animais pela exposição ao dióxido de carbono e à luxação cervical. Passo crítico: A ação excessiva de puxar a pele durante a luxação cervical pode danificar o enxerto. Na autópsia, extirem cirurgicamente as queimaduras dorsais na fáscia usando uma tesoura. Feridas de bissecto. Corrija metade em formalina tamponada de 10% e processo para histologia e imunohistoquímica. Congele rapidamente a outra metade em nitrogênio líquido para extração de RNA e quantitação de proteínas e mantenha-se a -80 °C. 7. Histologia da pele, imunohistoquímica e visualização de colágeno Incorpore amostras de pele em parafina, corte para seções de 4 μm e coloque em lâminas carregadas positivamente. Use slides manchados com hematoxilina e eosina para avaliar a taxa de re-epitelialização (% da ferida original). A área da ferida coberta com neo-epiderme pode ser expressa em percentagem de toda a ferida(Figura 4). Use um aplicativo de microscópio digital e um software ImageJ para realizar a análise microscópica das seções. Use seções histológicas (4 μm de espessura) preparadas a partir de tecido fixo e embutido em parafina e submá-los à imunohistoquímica. Para avaliar o colágeno I e a expressão da fibronectina nas feridas, aplique anticorpos primários e incubar por 1 h. A detecção pode ser realizada por peroxidase de rabanete específica da espécie (HRP) ou fosfatismo alcalino (AP)-conjugado anticorpos secundários. Reacionar seções com: (i) HRP,3,3′-diaminobenzidina (DAB) ou (ii) AP, Bond Polymer Refine Red (Tabela de Materiais), que produz uma cor vermelha brilhante(Figura 5). Escaneie as seções usando um instrumento e analise com o aplicativo de microscópio digital e ImageJ. Para habilitar a avaliação histológica da deposição de colágeno, realize a coloração tricrática em seções histológicas usando um kit comercial. Para visualização de fibra de colágeno, utilize microscopia multifotônica e segunda técnica de geração harmônica(Figura 5). Use um microscópio multifotono para imagens teciduais como descrito anteriormente20. Use um laser Ti:Safira com comprimento de onda central a 810 nm como fonte laser para gerar sinais de fluorescência harmônica e de dois fótons animados (TPEF). Use um raio laser equipado com um objetivo de 25x/0,95 W para coletar e excitar a segunda geração harmônica (SHG) e o TPEF. Detecte sinais como descrito anteriormente21 por detectores pmt ndd. Use software para controle de varredura a laser e aquisição de imagens.

Representative Results

Os resultados demonstram que o protocolo desenvolvido é um método simples, que permite a indução de uma ferida de queimadura de espessura total em camundongos. Queimaduras são induzidas usando um modelo de latão pré-aquecido(Figura 1A-C). A área queimada aparece como uma ferida circular com um eschar branco e uma zona hiperêmica. O tamanho da ferida queimada é ligeiramente maior às 24 horas após a lesão da queimadura como resultado do fenômeno bem descrito conhecido como progressão da lesão por queimadura, que possivelmente é devido à inflamação aguda22. Após a excisão, as feridas de queimadura são reconstruídas por meio de enxerto de pele aogenérica(Figura 3). No dia 7, após a lesão da queimadura, as feridas passam a ser vascularizadas5, o que é uma indicação de enxerto bem sucedido. Os queratinócitos epidérmicos migram da pele receptora adjacente no esforço de fechar a ferida e fazer a ponte entre as duas bordas das feridas. A análise microscópica das feridas manchadas de H e E revelou que o comprimento da neo-epiderme torna-se significativamente maior no dia 7 após lesão por queimadura em comparação com o dia 3 após lesão por queimadura(Figura 4B). Antes de realizar um grande estudo, é altamente recomendável que os pesquisadores completem um estudo piloto, que possibilite a exploração de uma nova intervenção, avaliação de viabilidade, identificação de modificações no método para garantir a reprodutibilidade. Efeitos estatisticamente significativos são difíceis de detectar em amostras menores, enquanto o aumento do tamanho da amostra é uma maneira de aumentar o poder estatístico de um teste. Por exemplo, para detectar uma diferença estatisticamente significante (p < 0,05) na taxa de re-epitelialização da ferida(Figura 4) entre os grupos, o tamanho da amostra deve ser entre seis e oito camundongos por grupo. Todos os experimentos devem ser repetidos pelo menos duas vezes. À medida que as células produtoras de matriz, como os fibroblastos, migram do tecido receptor para o enxerto, componentes-chave da matriz extracelular, incluindo colágeno I e fibronectina tornam-se altamente expressos na matriz recém-formada(Figura 5). Figura 1: Configuração do dispositivo em chamas. (A) Colocação e configuração do dispositivo de queima. O dispositivo de queima é conectado ao controlador de temperatura e é anexado ao monômetro digital para permitir o monitoramento da pressão. O dispositivo de queima é suspenso acima de um estágio ajustável – superfície plana sobre a qual os ratos são colocados para a indução de queimadura. (B-C) Uma imagem de perto do modelo de latão usado para induzir queimaduras de ferida. (C) O diâmetro do modelo de latão é de 1 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Ilustração esquemática das diferentes etapas necessárias para reproduzir o modelo experimental descrito neste artigo. Existem três etapas principais para o procedimento: (i) indução da ferida de queimadura usando um modelo de latão pré-aquecido; (ii) excisão cirúrgica do tecido necrosado não viável às 24 horas após a lesão da queimadura; (iii) reconstrução da ferida cirúrgica utilizando um enxerto de pele aogenógena de espessura total colhido de um rato doador. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: A visão macroscópica das feridas de queimaduras reconstruídas do rato. Imagens digitais representativas de queimaduras reconstruídas com enxertos de pele aogenógenos nos dias 0, 1, 3 e 7 após queimaduras. A régua nas imagens está em milímetros. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Aparecimento microscópico de feridas aos 3 e 7 dias após lesão por queimadura. Seções manchadas de H&E de feridas 3 e 7 dias após ferimentos de queimadura. O comprimento da neo-epiderme (linha pontilhada) é significativamente aumentado em (A) dia 3 feridas em comparação com(B) dia 7 feridas. Em (A) e (B), a barra de escala é de 100 μm. (C) Representação gráfica da porcentagem de re-epitelialização da ferida. Este foi avaliado medindo o comprimento da neo-epiderme nos dias 3 e 7 lesões pós-queimadura e expressas como uma porcentagem de todo o comprimento da ferida. Os resultados representam média ± S.E.M. (n = 6 camundongos no grupo dia 3; n = 6 camundongos no grupo do dia 7, *p < 0,05; Teste t do aluno). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Avaliação da matriz extracelular e visualização do colágeno I. Imagens representativas da análise imunohistoquímica no dia 7 feridas de camundongos manchadas para (A) colágeno e (B) fibronectina. Note uma mancha vermelha intensa em células de colágeno em forma de fuso alongado. Note manchas marrons em células fibronectina-positivas na derme do dia 7 feridas. Barra de escala = 50 μm em todas as imagens. Em (A) e (B), e denota epiderme e d denota derme. (C) Visualização de fibras de colágeno e avaliação histológica da deposição de colágeno. (D) Imagem representativa do colágeno TPEF/SHG das feridas do rato do dia 7. A aquisição simultânea de TPEF/SHG utilizando polarização circular e sinais SHG foram seletivamente processados para obter uma distribuição binária de SHG após a aplicação de um limiar. As imagens TPEF (verde) e SHG (branca) eram pseudocoloridas e sobrepostas. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

De acordo com a classificação de espessura da lesão por queimadura23,as queimaduras de espessura total são caracterizadas pelo evidente envolvimento de toda a espessura da pele e determinada porção do tecido subcutâneo. Este tipo de ferida só pode curar por contração ou com enxerto de pele2. Uma limitação inerente ao método descrito neste artigo é que apenas enxertos de espessura total, em oposição aos enxertos de espessura dividida, que são frequentemente utilizados no cenário clínico, foram colhidos da cauda de um camundongo. Isso se deveu à dificuldade técnica, já que a pele do rato é muito fina para obter enxertos de espessura dividida. Deve-se ressaltar que os enxertos de espessura total requerem um leito de ferida bem vascularizado, enquanto os enxertos de pele de espessura dividida são capazes de sobreviver em locais doadores com menor vascularidade24. Estudos anteriores mostraram que uma ferida de queimadura induzida na parte de trás do camundongo estava associada a uma formação robusta de nova vasculatura5. Isso sugere que uma área bem vascularizada, como o dorso do camundongo, poderia ser considerada como o marco anatômico para a indução de queimaduras.

A profundidade da ferida de queimadura é um fator importante a considerar. A profundidade da ferida de queimadura deve ser consistente entre ratos individuais. A reprodutibilidade da profundidade da ferida de queimadura depende da temperatura do modelo de latão, pressão e duração da exposição ao calor. A profundidade da ferida de queimadura deve ser verificada histologicamente. É importante ter em mente que a pressão excessiva ou a exposição prolongada da pele ao modelo de latão pré-aquecido podem ferir o tecido subjacente. O tecido ao redor da coluna vertebral, incluindo os componentes do sistema nervoso central e periférico, são sensíveis ao calor, e se danificados podem resultar em paralisia da perna traseira.

Embora nenhuma mortalidade pós-operatória tenha sido diretamente associada ao procedimento cirúrgico, um pequeno número de camundongos SKH1-Hrhr sem cabelo, que são especialmente sensíveis ao frio, desenvolveram hipotermia e não se recuperaram após a anestesia geral. Portanto, o calor suplementar deve ser fornecido durante todos os eventos estéticos e é necessária vigilância constante enquanto o rato é anestesiado.

O método descrito neste estudo não foi associado à infecção no local cirúrgico. No entanto, a técnica asséptica deve ser utilizada para evitar a transferência de microrganismos para a ferida cirúrgica durante o período perioperatório. A inoculação da ferida com microrganismos bioluminescentes ou fluorescentes pode ser incorporada ao procedimento. Esta técnica pode ser útil no estudo de organismos infecciosos e sua patogênese25. Por exemplo, a adição exógena ou injeção de bactérias bioluminescentes, pode permitir o monitoramento da carga microbiana utilizando a imagem animal in vivo inteira25. Dado que o cabelo de rato é conhecido por interferir com a fluorescência animal in vivo e a imagem de bioluminescência, os camundongos SKH1-Hrhr sem cabelo são os anfitriões ideais para os estudos envolvendo repórteres fluorescentes ou bioluminescentes.

Amostras de tecidos de feridas podem ser coletadas em diferentes pontos de tempo e processadas para análise histológica e imunohistoquímica. Proteína e RNA podem ser isolados da biópsia da pele e técnicas de biologia molecular podem ser usadas para avaliar a expressão de moléculas-chave envolvidas na cicatrização de feridas.

No presente estudo, descrevemos um modelo experimental de cicatrização de feridas queimadas e enxerto aogenético da pele. Este procedimento pode ser modificado e servir como modelo para estudos pré-clínicos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado por La Direction Générale de L’Armement, l’Agence de l’Innovation de Défense e École Polytechnique. Agradecemos ao nosso colega Yann Plantier, da École Polytechnique, que forneceu insights e conhecimentos que ajudaram muito na produção do arquivo de vídeo. Os autores agradecem aos senhores deputados Benoit Peuteman e Charlotte Auriau do INSERM Lavoisier (SEIVIL) US 33, Hôpital Paul Brousse, Villejuif pelo seu bem-estar animal e pela experiência assistencial fornecida durante o curso deste projeto.

Materials

1 ml syringue Terumo SS + 01T1
26 G needle Terumo Agani NN-2613R 1/2'' – 0,45 X 12mm
96X21 mm Petri Dish Dutscher 193199
Animal Weighing scale Kern EMB 5.2K5
BALB/c mouse Janvier labs BALB/cAnNRj 6-weeks old
Biopsy foam pads 30.2X25.4X2mm Simport M476-1
Bond polymer Refine Red Leica Biosystems DS9390
Brass block BVG custom-designed Circular 10 mm in diameter
Buprenorphine (BUPRECARE) Axience FR/V/6328396 3/2011 administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g
Burning apparatus Kausistar 400 TraçaMatrix 34010
CaseViewer 3DHISTECH Ltd. 3Dhistech, Budapest, Hungary
Collagen I antibody Abcam ab34710 Recommanded concentration 1:50; 1:200
D-(+)- glucose (Dextrose) Sigma Aldrich G-8769-100 ml
DAB Leica Biosystems AR9432
Digital camera NIKON D3400 objective: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45
Depilating cream Veet
Disposable scalpels Swann Morton 6601
DPBS PAN biotech P04-36300
Ethanol absolute VWR chemicals 20821.310
Fibronectin antibody Abcam ab23750 Recommanded dilution 1:1000
Filter 0.22um Sartorius 16532
Fine Scissors F.S.T. 14094-11
Forceps Dumont F.S.T. 11295-10
Hair clippers AESCULAP B00VAQ4KUY (ISIS)
Heating pad Petelevage 120070
Isofluorane Piramal healthcare FR/V/03248850/2011
Ketamine Imalgene FR/V/0167433 4/1992 surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 100mg/kg
Lactated Ringers solution Flee-Flex 1506443
Lamina multilabel slide scanner Perkin Elmer
LAS software Leica version 2.7.3
Leica Bond III Leica Biosystem 1757
Leukosilk dressing BSN medical 72669-01
Lidocaine Aguettant N01BB02 local analgesic, administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g
Manometer Kern HDB-5K5
Masson Trichrome Staining kit Sigma-Aldrich HT15-1KT
Micromesh Biopsy cassettes Simport M507
Multiphoton inverted stand Leica SP5 microscope Leica microsystems DM500 Scanner 8000Hz NDD PMT detectors
Non adhering dressing Adaptic Systagenix A6222 12.7cm X 22.9 cm
Ocrygel Tvm France ###
Paracetamol 300mg Dolliprane Liquiz
Paraformaldheyde 4% VWR chemicals 1169945
Povidone-iodine MEDA pharma D08AG02 diluted to 1:2
SKH1-Hrhr mouse Charles river 686SKH1-HR 6-weeks old
Slides Thermoscientific AGAA000080
Surgical adhesive BSN medical 9927
Sterile Gauze Hartmann 418545/9 10 X 10 cm
Sterile water Versylene Fresenius B230521
Surgical drape Hartmann 2775161
Ti:Sapphire ChameleonUltra Coherent DS 16-02-16 F 690-1040 nm
Thermal imaging Camera Testo Testo 868
Xylazine (Rompum 2%) Bayer FR/V/ 8146715 2/1980 surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg
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Blaise, O., Duchesne, C., Banzet, S., Rousseau, A., Frescaline, N. A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft. J. Vis. Exp. (162), e61339, doi:10.3791/61339 (2020).
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