JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

מודל מורנה של פצע צריבה שוחזר עם שתל העור Allogeneic

Published: August 08, 2020
doi:
10.3791/61339
, , , ,
1Laboratoire de Physique des Plasmas, École Polytechnique,Sorbonne Université, CNRS, 2Institut de Recherche Biomédicale des Armées, Clamart,INSERM UMRS-MD

Summary

מטרת המחקר הזה היתה לפתח מודל מורטין של ריפוי פצע כוויות. כוויה תרמית המושרה על העור החלק של עכברים באמצעות תבנית פליז מחומם מראש. הרקמה הנשרפה הייתה מצופה בשתל עור שנקטפו מזנבו של עכבר תורם דומה גנטית.

Abstract

פצעים שטחיים טריוויאליים מחלימים ללא סיבוכים בכוונה ראשונית. פצעים עמוקים, כגון כוויות בעובי מלא, מחלימים על ידי כוונה משנית ודורשים השתלת כירורגית והשתלה בעור. שילוב מוצלח של השתל התורם למיטה פצע המטופל תלוי בגיוס מבעוד מועד של תאים חיסוניים, תגובה אנגיוגנטית חזקים היווצרות מטריצה חדשה. התפתחות של הסוכנים הטיפוליים החדשניים, אשר היעד כמה תהליכים מרכזיים המעורבים בריפוי הפצע, מסוכלים על ידי חוסר מודלים אמין טרום קלינית עם הערכה אובייקטיבית ממוטבת של סגירת הפצע. כאן, אנו מתארים מודל זול ומלא השחזור של פצע מלאה של שריפת עובי של שוחזר עם שתל העור allogeneic. הפצע הוא המושרה על פני השטח dorsum של עכברים רדימים מסוג פראי של BALB/C ו SKH1-Hrhr. הכוויה מופק באמצעות תבנית פליז מדידה 10 מ”מ קוטר, אשר מחומם עד 80 ° c ומועברת בלחץ קבוע עבור 20 s. לצרוב eschar הוא מגורש 24 שעות לאחר הפציעה והוחלף השתל עובי מלא שנקטפו מהזנב של עכבר תורם דומה גנטית. ציוד מיוחד לא נדרש עבור הליך טכניקות כירורגי הם פשוט לעקוב. השיטה עשויה להיות מיושמת מאמץ ולשכפל את רוב הגדרות המחקר. מגבלות מסוימות משויכות למודל. בשל הקשיים הטכניים, הקציר של דליל מפוצל עובי שתלי העור אינו אפשרי. השיטה הכירורגית שאנו מתארים כאן מאפשרת שחזור של פצעי כוויות באמצעות שתלי עור מלאים בעובי. זה יכול לשמש כדי לבצע בדיקות טיפוליות טרום קלינית.

Introduction

השתלה כירורגית והשתלת עור הינם שיטות קליניות נפוצות המשמשות לניהול פצעים כרוניים1, פצעי כוויות2ופצעים חריפים כגון פצעים טראומטיים3. השתלת עור מתייחסת להליך הכירורגי, הכרוך בהסרת עור בריא מחלק אחד של הגוף והעברתו לאחרת. שתלי התורמים מחליפים את הרקמה האבודה ומספקים פיגום מבני להגירה וצמיחה תאית. לאחר שילוב לתוך אתר הנמען, שתלי העור להחליף את מכשול העור איבד על ידי מתן הגנה מפני פלישה חיידקים, השפעות מזיקות של הסביבה החיצונית ואובדן מוגזם של לחות4. שילוב מוצלח של שתל העור תלוי במספר גורמים. אלה כוללים תגובות החיסון הולם בנוכחות של זיהומים חיידקים ורזולוציה בזמן של דלקת, אנגיוגנזה חזק באתר הפצע והקמת האנסטוזות כלי דם בין מיטת הנמען לבין שתל התורם5. כמו השתל מתחיל לבזות, התאים העורי תושב חייב להיות מוחלף על ידי תאים המסוגלים לייצר מטריקס החילוץ החדש. באותו זמן, keratinocytes עוריות חייב לזחול מעל מטריצה המיוצר החדש כדי ליצור את באפידרמיס הניאו מחדש רקמות הפצע. לכן, ברור כי הגירה יעילה של תאים ממיטת הנמען אל שתל התורם היא גורם נוסף המשפיע על התאגדות שתל מוצלחת. בהינתן מספר עצום של גורמים המעורבים בריפוי הפצע6, אשר עשוי להיות בלתי אפשרי לשלוט בניסויים האנושיים בשל מגבלות אתיות, מודלים של טרום קלינית השתלת עור ניסיוני הם נחוצים. פיתוח מודלים פרה-קליניים של ריפוי פצעי כוויות והשתלת עור משויכת יהיו חשובים להבנת מנגנונים מורכבים המעורבים בתיקון רקמות עורית וחיוניים לבדיקות של סוכנים טיפוליים חדשים. המודלים החוץ-גופית של ריפוי הפצע אינם מסוגלים לחקות במדויק את המורכבות של הרקמה העורית. בדגמי החיות הvivo מדובר בכלי חקירה הכרחי להבנת המנגנונים המעורבים בתיקון רקמות.

כמה שיטות של השתלת העור הטכניקה פותחו במכרסמים כדי לחקות כריתה כירורגית לשרוף פצע שחזור7,8,9. עם זאת, רוב ההליכים שתוארו קודם לכן לא הצליחו לגרום לפגיעה בכוויות תרמית לפני השתלת העור. במקום פצע הכוויה, פצע מאוד מתוח בעובי המושרה, אשר שוחזר לאחר מכן עם אלושתל עובי עור מלא7. ציוני דרך שונים כגון האוזן, זנב וגב שימשו לקציר של העור התורם במכרסמים7,8. קיבוע השתל שונים וטכניקות ייצוב דווחו, כולל “אין טכניקת תפר” 9,תפרים 7 ודבק כירורגי10,11,12.

מטרת מחקר זה היתה לפתח מודל מורטין של פצע שריפת עובי מלא שהיה מסכם את הגישה הנוכחית לתקן זהב בטיפול בכוויות, הכוללת כריתה ללא קיימא רקמות והשתלת עור. כוויה תרמית הושרה על משטח הדורסום של העכבר באמצעות תבנית פליז מחוממת. Eschar לצרוב היה לאחר והוחלף בשתל עובי מלא שנקטפו מזנב של עכבר תורם. יש שלושה יתרונות עיקריים. למודל הניסיוני הזה ראשית, יותר מפצע כוויות אחד יכול להיות המושרה על גבו של עכבר הנמען, וארבעה שתלי עור תורם עשוי להיות נקצרו מזנב אחד של העכבר התורם. משמעות הדבר היא כי מספר טיפולים ניסיוניים ושליטה עשויים להיות מושווים באמצעות אותו הנמען ובעלי חיים תורמים. בהתאם לתוואי הרצוי של המינהל, הטיפול בקרת עשוי לכלול מינהל מקומי או מערכתי של הרכב או בקרת פלצבו (למשל, יישום מקומי של משחה, תת עורית, הצפק או ורידית של הפתרון). שנית, תזמון הטיפול ונקודת הקצה של הניסוי עשוי להיות נשלט. שלישית, מודל זה תלוי בשחזור של פצעים באמצעות שתלי עובי מלאה שנקטפו מן הזנב, אשר ידוע כי יש סבירות גבוהה יותר עבור התאגדות מוצלחת לתוך אתר התורם לעומת העור שנקטפו מן הגב13. זה יכול להיות בגלל המספר הנמוך של תאים Langerhans באפידרמיס, אשר לשחק תפקיד מפתח בביולוגיה חיסונית, והם משויכים השתל העור דחייה14.

המודל המוצע של ריפוי הפצע ואינטגרציה השתל עשוי להיות מיושם גם עכברים הסתרה והפצצה. השימוש בעכברים מהונדסים גנטית יסייע בהסבר התפקידים גנים מסוימים עשויים לשחק במהלך תיקון הפצע. יישום אקסוגני של ההכנות לפצע אקטואלי או מינהל תת-עורי של נוגדנים טיפוליים באתר הפציעה יכול להיחשב גם.

בשל קשיים טכניים, פיצול שתלי עור עובי המורכב של האפידרמיס וחלק דרמיס קשה להשיג עכברים. שתלי עור בעובי מלא המורכב של האפידרמיס ואת מלאה בעובי דרמיס ידועים לדרוש מיטה פצע היטב שילוב מוצלח. חוסר יכולת הקציר פיצול עובי שתלי העור בעכברים עשוי להיחשב כמגבלה של מודל זה. קיבוע של השתל העור למיטה פצע המטופל הושג באמצעות יישום של דבק דביק כירורגי, אשר קשורה פחות טראומה והשפלה מהירה בהשוואה לאמצעים אחרים של קיבוע רקמות15. מחקרים קודמים הראו כי תפירה קשורה קיבוע רקמה חזקה יותר מאשר דבק כירורגי ב 24 שעות אחרי ההליך כירורגי15, אשר עשוי להיחשב חיסרון של ההליך. עם זאת, בנקודות זמן מאוחרות יותר, החוזק הביומכאני של פצעים שטופלו בדבק כירורגי הופך להיות דומה לתפרים15 ויותר טוב מקיבוע הידוק16. הפצעים חייבים להיות מכוסים. בעזרת רוטב הפצע למרות שפצעים על פני העכבר מתקשים להגיע לבעל החיים, ההלבשה הפצועה, מצד שני, קלה לבעלי החיים לתמרן ולהסיר. שינויים תכופים ההלבשה הפצע עשוי להיות מוצדקת.

היפותרמיה מושרה בהרדמה באמצעות מכרסמים קטנים היא תופעה מתועדת היטב17. היפותרמיה היא תופעת לוואי של הליך זה, הגורם לסיבוכים, ועלול להתפשר הן על בריאות בעלי חיים והן על איכות הנתונים. לכן, שיטה זו מצדיקה את היישום של אסטרטגיות ניהול טמפרטורה, במיוחד אם שיער SKH1-Hrhr משמשים.

המגבלה המשמעותית ביותר של שימוש בעכברים כדי לחקות את סגירת הפצע האנושי הוא ההבדל בין אנטומיה העור לפיזיולוגיה. פצעי עכבר לרפא בעיקר באמצעות התכווצות, בעוד פצעים אנושיים לרפא באמצעות היווצרות רקמות גרטולציות ו-האפיתל מחדש18. כדי להסביר את הפער הזה, המודל הנוכחי עשוי להיות שונה ומשמש בשילוב עם טבעת קיבועים דבקה היטב סביב הפצע כדי למנוע התכווצות העור19. בהינתן כמה יתרונות וחסרונות של זה בפרוטוקול vivo, מודל זה יכול לשמש ככלי לחקר תהליכים מסוימים מעורב בריפוי פצע כי הם בלתי אפשרי ללמוד מבחנה.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי המחלקה הצרפתית להשכלה גבוהה ומחקר (מספר מחקר: 122162017111616517670v2 ו-DAP180012). כל העכברים היו שוכנו עם הגעתם בכלובים פלסטיים והורשו לתקופת ההסתגלות של 7 ימים לפני המחקר. החדר בעל החיים היה מתוחזק על אור 12/12 h/מחזור כהה (אורות on ב 07:00). המזון ומים הברז סופקו כיום לפני הספירה. לעכברים BALB/c ו-SKH1-Hrhr הוזן דיאטה מסורתית מבוססת חיטה/סויה. ביחד עם חומר קינון ניתן לעשות שיטות נסורת. 1. הכנת ציוד הכן מכשיר בוער לפרוצדורה והגדר אותו ל-80 ° צ’ באמצעות בקר הטמפרטורה (איור 1A). בדוק את טמפרטורת תבנית הפליז (איור 1ב, ג) באמצעות מצלמת ההדמיה התרמית אינפרא-אדום. ודא שמטר המנמד הדיגיטלי פועל כראוי. כסו את הבמה בעזרת כיסוי כירורגי והתאימו את גובה השולחן (איור 1A). 2. טיפול טרום-ניתוח ובעלי חיים פנים-אופרטיביים לרכוש BALB/c ו SKH1-Hrhr עכברים, 6-8 שבועות של גיל. הוסף אקמול ההשעיה ב 3 מ”ג/mL כדי לשתות מים ולספק 12 שעות לפני ועד 72 שעות לאחר ההליך. באמצעות מזרק 1 מ ל ו-26 מחט G, מנהל בופרנורטין תת-עורי ב 0.05 μg/G 30 דקות לפני ההליך ואת כל 6 שעות הראשון 72 שעות לאחר ההליך. באמצעות מזרק 1 מ ל ומחט של 26 גרם, מנהל לידוקאין כדי dorsum של העכבר ו 2-3 מ”מ מילימטר לאזור של פצע הכוויה. הכנס לידוקאין ב 0.05 μg/g תת-עורי 15 דקות לפני האינדוקציה של פצע הכוויה. עכברים מורדם באמצעות הזרקה תוך הצפק של xylazine ב 10 מ”ג/ק”ג וקטמין 100 מ”ג/ק”ג. השתמש מזרק 1 מ ל ומחט של 26 G כדי לפקח על הזריקה. צעד קריטי: מניחים את העכבר רדימים על משטח מחומם ולשמור על העכבר חם כדי למנוע היפותרמיה עבור 30 הדקות הראשונות לאחר אינדוקציה של הרדמה ו לפחות 15 דקות לאחר ההתאוששות מן ההרדמה. בנוסף למשטח המחומם, שיטות אחרות הכוללות מנורות חום, במחזור נוזלים חמים או אוויר, ומאגרי חום מחוממים עשויים לשמש לוויסות טמפרטורת הגוף. החלת שימון ג’ל על העיניים של העכבר כדי למנוע התייבשות של הקרנית. השתמש רפלקס נסיגה הבוהן להעריך את עומק ההרדמה. באמצעות מזרק 1 מ ל ו -26 המחט G מנהל 200 μL של הפתרון של הרטמן בתוספת 5% דקסטרוז. ניהול החלפת נוזלים תת-עורי מיד לאחר אינדוקציה של הרדמה 6 שעות לאחר ההליך כדי למנוע התייבשות. 3. מלוא עובי שריפת הפצע האינדוקציה לגלח את העכבר הרדימים עם קוצץ שיער. החלת קרם depilating על משטח דורסום של העכבר לדקה אחת. לנגב את השמנת באמצעות גזה סטרילי ולנקות את האזור עם פיסת גזה לח. למחוק את העור עם גזה כמה עד יבש. הניחו את העכבר על הבמה מכוסה בכיסוי כירורגי והזיזו את השלב קרוב יותר לתבנית הפליז המחוממת. החל את תבנית כלי הנשיפה העגולים בחלק האחורי של העכבר (80 ° צ’ עבור 20 s) בלחיצה מתמדת של 0.15 N (איור 2). שלב קריטי: מיד לאחר אינדוקציה הבעירה, למקם את החיה רדימים על המשטח מחומם כדי למנוע היפותרמיה ולשמור על העכבר חם במהלך ואחרי ההליך. , פעם התאושש מהרדמה. החזר את העכבר בחזרה לכלוב שלב קריטי: לספק מחית הדיאטה על רצפת הכלוב הראשון 72 שעות לאחר ההליך הכירורגי. עכברים לפעמים מסרבים להגיע עד צינור לוגמת לשתות מים לאחר פציעה פצע כוויות. 4. קצירת שתל התורם לעשות חתך האורך עם אזמל בחלק העליון של הזנב של העכבר תורם בעדינות להסיר את העור באמצעות מלקחיים כירורגי. מניחים את העור הזנב לתוך צלחת פטרי סטרילית מלא 10 מ ל של התמיסה סטרילי 0.9% מלוחים. השתמש בסרגל כדי למדוד את השתלים בודדים לחתוך את העור הזנב לחתיכות, כל מדידה 15 מ”מ, באמצעות אזמל. פעם אחת הכין, לשמור על שתלי העור ב 0.9% תמיסת מלח ב 4 ° צ’ עבור עד 2 שעות. 5. כריתה כירורגית והשתלת עור עשרים וארבע שעות לאחר אינדוקציה הכוויה, הכינו את העכבר להרדמה על ידי שאיפת איזוofלאנה. מניחים את העכבר לתוך התא אינדוקציה ולגרום הרדמה באמצעות 5% isofלוריאן ב 100% חמצן בקצב הזרימה של 4 L/min. כדי לשמור על ההרדמה במהלך הניתוח, השתמש ב-2% isofלוריאן ב 2 L/min. מניחים על העכבר כירורגיה כירורגית וחותכים את החלון כדי לחשוף את השדה הכירורגי. באמצעות טכניקת אספטי, לנקות את הפצע הראשון עם povidone-יוד ולאחר מכן עם 70% אלכוהול. בעדינות להרים את הרקמה הנשרפה עם זוג מלקחיים כירורגית ו-בוהן רקמת נמק ורקמות לא קיימא עם מספריים כירורגי סטרילי ומלקחיים. הסירו את שכבת ההיפודרמיס ליצירת מיטת הנמען היציבה. הניחו את שתל העור על מיטת הפציעה הטרייה שהוכנה. משוך בעדינות את העור שמסביב לעבר שתל העור באמצעות פינצטה כירורגית. להחיל כמה דבק כירורגי כדי לצרף את השתל למיטה הפצע ללחוץ בעדינות כדי ליישר את קצות העור. צעד קריטי: גודל מיטת הפציעה חייב להיות קטן יותר מהגודל של שתל העור כדי להבטיח העפילה מוצלחת. לאפשר לעכבר להתאושש מהרדמה. צעד קריטי: מניחים את העכבר על משטח מחומם. לשמור על העכבר חם במהלך ואחרי ההליך כדי למנוע היפותרמיה. החלת פרפין התחבושת גזה וההלבשה משני דבק על הפצע הושתל. למקם את העכבר לתוך כלוב יחיד. צעד קריטי: לספק כמה מחית דיאטה על רצפת הכלוב עבור הראשון 72 שעות אחרי הליך כירורגי ניטור מדי יום. לספק צעצועים ולהעשיר את הסביבה. 6. הדמיה דיגיטלית וגביית פצעים שלאחר המוות פצעי צילום במצלמה דיגיטלית על ידי הצבת סרגל ליד הפצע (איור 3). בנקודת הסיום של הניסוי, המתת החסד בעלי חיים על ידי חשיפה פחמן דו חמצני ופריקה צוואר הרחם. שלב קריטי: פעולת משיכת מוגזמת של העור במהלך הפריקה הצווארי עלולה לגרום נזק השתל. בניתוח שלאחר המוות, בבלו את פצעי הכוויה הfascia במספריים. . פצעי בישועי לתקן חצי ב 10% פורמאלין באגירה ותהליך עבור היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה. הקפאה מהירה של החצי השני בחנקן נוזלי להפקת RNA וכימות חלבון ולשמור ב-80 ° c. 7. עור היסטולוגיה, אימונוהיסטוכימיה והדמיית קולגן להטביע דגימות של העור לתוך פרפין, לגזור 4 יקרומטר סעיפים ומקום אל שקופיות טעונה באופן חיובי. השתמש בשקופיות מוכתמות במטאוקסילין ובאאוזין כדי להעריך את קצב האפיתל מחדש (% מהפציעה המקורית). האזור של הפצע המכוסה באפידרמיס הניאו עשוי להתבטא כאחוז של הפצע כולו (איור 4). השתמש ביישום מיקרוסקופ דיגיטלי ובתוכנת ImageJ לביצוע ניתוח מיקרוסקופי של המקטעים. השתמש סעיפים היסטלוגיים (4 יקרומטר עובי) מוכן formalin-קבוע, פרפין רקמה מוטבעת הנושא אותם לאימונוהיסטוכימיה. כדי להעריך קולגן I ו-fibronectin ביטוי פצעים, להחיל נוגדנים העיקרי הדגירה עבור 1 h. איתור עשוי להתבצע על ידי מינים ספציפיים peroxidase (HRP) או בסיסי פוספספטאז (AP)-נוגדנים משניים מצופנים. להגיב מקטעים עם או: (i) HRP, 3, 3 ‘-diaminobenzidine (בתוך) או (ii) AP, בונד פולימר לחדד אדום (טבלת חומרים), אשר מניב צבע אדום בהיר (איור 5). סרוק את המקטעים באמצעות כלי נגינה ונתח בעזרת יישום המיקרוסקופ הדיגיטלי ו-ImageJ. כדי לאפשר הערכה היסטולוגית של התצהיר קולגן, לבצע מכתים trichrome על סעיפים היסטולוגית באמצעות ערכה מסחרית. עבור הדמיה של סיבי קולגן, השתמש במיקרופוטון ובטכניקת הדור השני (איור 5). השתמש מיקרוסקופ רב פוטון לדימות רקמות כפי שתואר בעבר20. השתמש Ti: לייזר ספיר עם אורך גל במרכז 810 nm כמקור לייזר ליצירת אותות הרמוניים השני, שני-פוטון נרגש (TPEF). השתמש קרן לייזר מצויד במטרה 25x/0.95 W לאסוף ולרגש הדור השני הרמוני (SHG) ו TPEF. זהה אותות כמתואר בעבר21 על-ידי גלאי PMT ndd. השתמש בתוכנה לבקרת סריקת לייזר ורכישת תמונות.

Representative Results

התוצאות מראות כי הפרוטוקול שפותח הוא שיטה פשוטה, אשר מאפשרת אינדוקציה של פצע מלאה שריפת עובי בעכברים. ברנס מושרה בתבנית פליז מחוממת (איור 1א-ג). האזור השרוף מופיע כפצע מעגלי עם כדוריות לבנות ואזור היפרמית. הגודל של פצע הכוויה הוא קצת יותר גדול ב 24 שעות לאחר פגיעת הכוויה כתוצאה של התופעה מתוארת היטב המכונה התקדמות פציעת כוויות, אשר אולי בשל דלקת חריפה22. לאחר כריתה, פצעי הכוויה משוחזרים באמצעות השתלת עור אלוגנמית (איור 3). ביום השביעי לאחר פגיעת הכוויה, הפצעים הופכים להיות ואצלב5, המעיד על העפילה המוצלח. Keratinocytes עוריות לעבור מן העור הנמען הסמוך במאמץ לסגור את הפצע לגשר על הפער בין שני הקצוות של הפצעים. ניתוח מיקרוסקופי של H ו-E סעיף מוכתם של פצעים חשף כי אורכו של הניאו-אפידרמיס הופך באופן משמעותי יותר ביום 7 לאחר פגיעת כוויות בהשוואה ליום 3 לאחר פגיעת כוויות (איור 4B). לפני ביצוע מחקר גדול, מומלץ מאוד כי החוקרים להשלים מחקר פיילוט, אשר מאפשר את החקירה של התערבות רומן, הערכה של היתכנות, זיהוי של שינויים בשיטה כדי להבטיח הזדהות. השפעות משמעותיות מבחינה סטטיסטית קשה לזהות בדגימות קטנות יותר, בעוד הגדלת גודל המדגם היא דרך אחת כדי להגביר את הכוח הסטטיסטי של מבחן. לדוגמה, כדי לזהות הבדל משמעותי סטטיסטית (p < 0.05) בקצב האפיתל מחדש הפצע (איור 4) בין קבוצות, גודל המדגם צריך להיות בין שישה ושמונה עכברים לכל קבוצה. יש לחזור על כל הניסויים לפחות פעמיים. כמו מטריקס הפקת תאים, כגון פיברותקיעות, להגר מרקמת המטופל לתוך השתל, רכיבי מפתח של מטריצה החילוץ, כולל קולגן אני ו fibronectin להיות מבוטא באופן מאוד במטריצה החדשה (איור 5). איור 1: התקנת התקן בוער. (א) השמה והגדרת המכשיר הבוער. המכשיר הבוער מחובר לבקר הטמפרטורה ומחובר למונמטר הדיגיטלי כדי לאפשר ניטור של לחץ. המכשיר הבוער הוא הושעה מעל שלב מתכוונן-משטח שטוח שעליהם עכברים ממוקמים עבור אינדוקציה של צריבה. (B-C) תמונה מקרוב של תבנית פליז משמש כדי לגרום כוויות הפצע. (ג) קוטרו של תבנית הפליז הוא 1 ס מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: איור סכמטי של השלבים השונים הנדרשים לשכפול המודל הנסיוני המתואר במאמר זה. ישנם שלושה צעדים עיקריים להליך: (i) אינדוקציה של פצע הכוויה באמצעות תבנית פליז מחומם מראש; (ii) כריתה כירורגית של רקמת נקרוטיק הלא-קיימא במשך 24 שעות לאחר פגיעת הכוויות; (iii) שחזור פצע כירורגי באמצעות השתלת עור מלאה האלוגנאית שנקטפו מעכבר תורם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: התצוגה המקקרוסקופית של פצעי כוויות של העכבר המשוחזר. הנציג תמונות דיגיטליות של פצעי כוויות שוחזר עם שתלי העור allogeneic בימים 0, 1, 3 ו -7 לאחר פציעה בכוויות. הסרגל בתמונות הוא במילימטרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: מראה מיקרוסקופיים של פצעים בשלושה ושבעה ימים לאחר פגיעת כוויות. H & E-מוכתם קטעים של פצעים 3 ו -7 ימים לאחר פגיעת כוויות. אורכו של הניאו-אפידרמיס (קו מנוקד) גדל באופן משמעותי ב (א) יום 3 פצעים לעומת (ב) יום 7 פצעים. ב (א) ו-(ב), סרגל קנה המידה הוא 100 μm. (C) ייצוג גרפי של אחוז מחדש הפצע האפיתל. זה הוערך על ידי מדידת אורך של הנאו-אפידרמיס ביום 3 ו -7 לאחר הצריבה פציעה מבוטא כאחוז של אורך הפצע כולו. תוצאות מייצגות ממוצע ± S.E.M. (n = 6 עכברים ביום 3 הקבוצה; n = 6 עכברים ביום 7 הקבוצה, * p < 0.05; מבחן t של הסטודנט). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: הערכה של מטריצה החילוץ והקולגן אני ויזואליזציה. תמונות מייצגות של ניתוח אימונוהיסטוכימיה ביום 7 פצעי העכבר ויטראז ‘ (א) קולגן ו (ב) fibronectin. הערה מכתים אדום אינטנסיבי בצורת ציר מאורכים קולגן התאים I-חיובי. הערה מכתים חום ב fibronectin-תאים חיוביים ביום 7 פצעים. סרגל קנה מידה = 50 יקרומטר בכל התמונות. ב (א) ו-(ב), e מציין אפידרמיס ו d מציין. (ג) ויזואליזציה של סיבי קולגן הערכה היסטולוגית של התצהיר קולגן. (ד) נציג TPEF/shg התמונה קולגן של היום 7 פצעי עכבר. רכישה בו של TPEF/SHG בו באמצעות שידורי הקיטוב המעגלי ואותות SHG עובדו באופן סלקטיבי כדי לקבל התפלגות בינארית של SHG לאחר החלת סף. תמונות TPEF (ירוק) ותמונות SHG (לבן) היו בצבע מדומה ומצופים. סרגל בקנה מידה = 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

לפי סיווג העובי של פגיעה בכוויות23, כוויות מלאות עובי מתאפיינות במעורבות ניכרת של העובי המלא של העור וחלק מסוים של הרקמה התת עורית. סוג זה של פצע יכול לרפא רק על ידי התכווצות או עם השתלת עור2. הגבלה הטבועה של השיטה המתוארת במאמר זה היא כי רק שתלי עובי מלא, בניגוד שתלי עובי מפוצל, אשר משמשים לעתים קרובות בהגדרה הקלינית, נקצרו מזנבו של העכבר. זה היה בגלל הקושי הטכני, כמו העור העכבר דק מדי כדי להשיג השתלות עובי מפוצל. זה חייב להיות ציין כי שתלי עובי מלאה דורשים מיטה הפצע היטב, בעוד פיצול עובי שתלי העור מסוגלים לשרוד באתרי תורם עם פחות vascularized24. מחקרים קודמים הראו כי פצע כוויות הנגרמת על גבו של העכבר היה קשור להיווצרות חזקה של ואסיקובלטורה חדש5. הדבר מצביע על כך שבאזור היטב, כגון הדורסום של העכבר, יכול להיחשב כנקודת הציון האנטומית לאינדוקציה של פצעי כוויות.

עומק הפצע לשרוף הוא גורם חשוב לשקול. עומק פצע הכוויה חייב להיות עקבי בין עכברים נפרדים. הביסטיה של עומק פצע הכוויה תלויה בטמפרטורת התבנית, הלחץ והמשך של חשיפת החום. יש לוודא את עומק פצע הצריבה. חשוב לזכור כי לחץ מופרז או חשיפה ממושכת של העור לתבנית פליז מחומם עלול לפגוע ברקמה הבסיסית. הרקמה המקיפה את עמוד השדרה, כולל מרכיבי מערכת העצבים המרכזית וההיקפית, רגישים לחום, ואם הנזק עלול לגרום לשיתוק הרגל האחוריות.

למרות שאין תמותת שלאחר המוות היתה קשורה ישירות ההליך כירורגי, מספר קטן של עכברים SKH1-Hrhr שיער, אשר רגישים במיוחד קר, היפותרמיה מפותחת ולא הצליחו להתאושש לאחר הרדמה כללית. לכן, החום המשלים חייב להיות מסופק במהלך כל האירועים אסתטי ומעקב קבוע נדרש כאשר העכבר הוא רדימים.

השיטה המתוארת במחקר זה לא היה משויך לזיהום באתר כירורגי. עם זאת, טכניקה אספטית יש להשתמש כדי למנוע את העברת מיקרואורגניזמים לתוך הפצע כירורגי במהלך התקופה הפריבית. ניתן לשלב בתהליך את החיסון באמצעות ביולומינטי או מיקרואורגניזמים פלורסנט. טכניקה זו עשויה להועיל ללימוד אורגניזמים זיהומיות והפתוגנזה שלהם25. לדוגמה, תוספת אקסוגני או הזרקה של בקטריה ביולומילטיות, עשויה לאפשר את ניטור הנטל של החיידקים באמצעות הדמיה של vivo בעלי חיים שלמים25. בהינתן כי שיער העכבר ידוע להפריע vivo של בעלי חיים שלמים והדמיה ביולומיסנס, עכברים שיער SKH1-Hrhr הם מארחים אידיאליים עבור המחקרים הכוללים כתבים פלורסנט או ביולוסנטי.

דגימות רקמת הפצע ניתן לאסוף בנקודות זמן שונות מעובד עבור ניתוח היסטולוגית ואימונוהיסטוכימיה. חלבון ו-RNA עשוי להיות מבודד מפני ביופסיה העור וטכניקות ביולוגיה מולקולרית עשוי לשמש כדי להעריך את הביטוי של מולקולות מפתח מעורב בריפוי הפצע.

במחקר הנוכחי, תיארנו מודל ניסיוני של ריפוי בפצעי כוויות והעור האלוגנאית. הליך זה ניתן לשינוי ולשמש כמודל למחקרים פרה-קליניים.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

העבודה הזאת נתמכת על-ידי “לה בימוי” דה לארג ‘, לסוכנות הידיעות לחדשנות דה דפנס ולקול פוליטכניקה. אנו מודים לעמיתינו מר יאן פלטייר מ-École פוליטכניקה, אשר סיפק תובנה ומומחיות שסייעו מאוד לייצור קובץ הוידיאו. המחברים מודים למר בנואה פטיימן ולגב שרלוט אוריאו מINSERM לי (העיר התחתית) US 33, הייפיטל פול בארוס, וילג’ואם עבור החיים שלהם ומומחיות הטיפול שסופקו במהלך פרויקט זה.

Materials

1 ml syringue Terumo SS + 01T1
26 G needle Terumo Agani NN-2613R 1/2'' – 0,45 X 12mm
96X21 mm Petri Dish Dutscher 193199
Animal Weighing scale Kern EMB 5.2K5
BALB/c mouse Janvier labs BALB/cAnNRj 6-weeks old
Biopsy foam pads 30.2X25.4X2mm Simport M476-1
Bond polymer Refine Red Leica Biosystems DS9390
Brass block BVG custom-designed Circular 10 mm in diameter
Buprenorphine (BUPRECARE) Axience FR/V/6328396 3/2011 administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g
Burning apparatus Kausistar 400 TraçaMatrix 34010
CaseViewer 3DHISTECH Ltd. 3Dhistech, Budapest, Hungary
Collagen I antibody Abcam ab34710 Recommanded concentration 1:50; 1:200
D-(+)- glucose (Dextrose) Sigma Aldrich G-8769-100 ml
DAB Leica Biosystems AR9432
Digital camera NIKON D3400 objective: SIGMA 18-250mm F3.5-6.3 DC MACRO C45
Depilating cream Veet
Disposable scalpels Swann Morton 6601
DPBS PAN biotech P04-36300
Ethanol absolute VWR chemicals 20821.310
Fibronectin antibody Abcam ab23750 Recommanded dilution 1:1000
Filter 0.22um Sartorius 16532
Fine Scissors F.S.T. 14094-11
Forceps Dumont F.S.T. 11295-10
Hair clippers AESCULAP B00VAQ4KUY (ISIS)
Heating pad Petelevage 120070
Isofluorane Piramal healthcare FR/V/03248850/2011
Ketamine Imalgene FR/V/0167433 4/1992 surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 100mg/kg
Lactated Ringers solution Flee-Flex 1506443
Lamina multilabel slide scanner Perkin Elmer
LAS software Leica version 2.7.3
Leica Bond III Leica Biosystem 1757
Leukosilk dressing BSN medical 72669-01
Lidocaine Aguettant N01BB02 local analgesic, administered subcutaneously at a dose of 0.05 μg/ g
Manometer Kern HDB-5K5
Masson Trichrome Staining kit Sigma-Aldrich HT15-1KT
Micromesh Biopsy cassettes Simport M507
Multiphoton inverted stand Leica SP5 microscope Leica microsystems DM500 Scanner 8000Hz NDD PMT detectors
Non adhering dressing Adaptic Systagenix A6222 12.7cm X 22.9 cm
Ocrygel Tvm France ###
Paracetamol 300mg Dolliprane Liquiz
Paraformaldheyde 4% VWR chemicals 1169945
Povidone-iodine MEDA pharma D08AG02 diluted to 1:2
SKH1-Hrhr mouse Charles river 686SKH1-HR 6-weeks old
Slides Thermoscientific AGAA000080
Surgical adhesive BSN medical 9927
Sterile Gauze Hartmann 418545/9 10 X 10 cm
Sterile water Versylene Fresenius B230521
Surgical drape Hartmann 2775161
Ti:Sapphire ChameleonUltra Coherent DS 16-02-16 F 690-1040 nm
Thermal imaging Camera Testo Testo 868
Xylazine (Rompum 2%) Bayer FR/V/ 8146715 2/1980 surgical anesthetic, administered intraperitoneally at a dose of 10 mg/kg
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shakir, S., et al. Indications and Limitations of Bilayer Wound Matrix-Based Lower Extremity Reconstruction: A Multidisciplinary Case-Control Study of 191 Wounds. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2019).
  2. Greenhalgh, D. G. Management of Burns. New England Journal of Medicine. 380 (24), 2349-2359 (2019).
  3. Bosse, M. J., et al. An analysis of outcomes of reconstruction or amputation after leg-threatening injuries. New England Journal of Medicine. 347 (24), 1924-1931 (2002).
  4. Braza, M. E., Fahrenkopf, M. P. . StatPearls. , (2019).
  5. Duchesne, C., Banzet, S., Lataillade, J. J., Rousseau, A., Frescaline, N. Cold atmospheric plasma modulates endothelial nitric oxide synthase signalling and enhances burn wound neovascularisation. Journal of Pathology. 249 (3), 368-380 (2019).
  6. Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), 266 (2014).
  7. Pakyari, M., et al. Local Expression of Indoleamine 2,3, Dioxygenase Prolongs Allogenic Skin Graft Take in a Mouse Model. Advances in Wound Care. 8 (2), 58-70 (2019).
  8. Pakyari, M., et al. A new method for skin grafting in murine model. Wound Repair and Regeneration. 24 (4), 695-704 (2016).
  9. McFarland, H. I., Rosenberg, A. S. Skin allograft rejection. Current Protocols in Immunology. , (2009).
  10. Cristobal, L., et al. Local Growth Hormone Therapy for Pressure Ulcer Healing on a Human Skin Mouse Model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), (2019).
  11. Melican, K., Aubey, F., Dumenil, G. Humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature. Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
  12. Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
  13. Larsen, C. P., et al. Migration and maturation of Langerhans cells in skin transplants and explants. Journal of Experimental Medicine. 172 (5), 1483-1493 (1990).
  14. Leonard, D. A., Kurtz, J. M., Cetrulo, C. L. Vascularized composite allotransplantation: towards tolerance and the importance of skin-specific immunobiology. Current Opinion in Organ Transplantationt. 18 (6), 645-651 (2013).
  15. Stoikes, N., et al. Biomechanical evaluation of fixation properties of fibrin glue for ventral incisional hernia repair. Hernia: The Journal of Hernias and Abdominal Wall Surgery. 19 (1), 161-166 (2015).
  16. Foster, K., et al. Efficacy and safety of a fibrin sealant for adherence of autologous skin grafts to burn wounds: results of a phase 3 clinical study. Journal of Burn Care & Research. 29 (2), 293-303 (2008).
  17. Caro, A. C., Hankenson, F. C., Marx, J. O. Comparison of thermoregulatory devices used during anesthesia of C57BL/6 mice and correlations between body temperature and physiologic parameters. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (5), 577-583 (2013).
  18. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research Techniques Made Simple: Animal Models of Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
  19. Wang, X., Ge, J., Tredget, E. E., Wu, Y. The mouse excisional wound splinting model, including applications for stem cell transplantation. Nature Protocols. 8 (2), 302-309 (2013).
  20. Ruzehaji, N., et al. Pan PPAR agonist IVA337 is effective in prevention and treatment of experimental skin fibrosis. Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (12), 2175-2183 (2016).
  21. Ruzehaji, N., et al. Combined effect of genetic background and gender in a mouse model of bleomycin-induced skin fibrosis. Arthritis Research & Therapy. 17, 145 (2015).
  22. Singer, A. J., Burn Boyce, S. T. Wound Healing and Tissue Engineering. Journal of Burn Care & Research. 38 (3), 605-613 (2017).
  23. Shakespeare, P. Burn wound healing and skin substitutes. Burns. 27 (5), 517-522 (2001).
  24. Sun, B. K., Siprashvili, Z., Khavari, P. A. Advances in skin grafting and treatment of cutaneous wounds. Science. 346 (6212), 941-945 (2014).
  25. Miller, R. J., et al. Development of a Staphylococcus aureus reporter strain with click beetle red luciferase for enhanced in vivo imaging of experimental bacteremia and mixed infections. Scientific Reports. 9 (1), 16663 (2019).

Tags

Murine ModelBurn WoundAllogeneic Skin GraftFull Thickness BurnSkin GraftThermal Burn Injury DeviceEpidermisDermisSubcutaneous FatSuperficial BurnsPartial Thickness BurnsFull Thickness BurnsSkin GraftingDonor MouseRecipient MouseInbred StrainHairless MiceWound HealingInfectionBacterial GrowthThermal Imaging Camera

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Blaise, O., Duchesne, C., Banzet, S., Rousseau, A., Frescaline, N. A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft. J. Vis. Exp. (162), e61339, doi:10.3791/61339 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image