Un modello di epileptogenesi nelle culture delle fette organotipiche della corteccia rinale-ippocampo

Il diritto portoghese e gli orientamenti dell’Unione europea (2010/63/UE) sono stati rispettati in tutte le procedure relative alla protezione degli animali a fini scientifici. Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall’Organismo istituzionale per il benessere degli animali (ORBEA-iMM) dell’iMM e dall’autorità nazionale competente (DGAV – Direção Geral de Alimentação e Veterinária). 1. Preparazione di fette di corteccia-ippocampo renale NOTA: La preparazione di fette di corteccia renale-ippocampo utilizza ratti P6-7 Sprague-Dawley. Impostazione della cultura e preparazione media Il giorno prima della coltura, preparare i supporti richiesti e posizionarli a 4 °C. Preparare il mezzo di dissezione: 25 mM di glucosio nella soluzione di sale bilanciato (GBSS) di Gey. Preparare il terreno di coltura: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% Siero di Cavallo (HS), 25 mM glucosio, 30 μg/mL Gentamicina. Preparare il mezzo di manutenzione: Neurobasal-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-glutammina, 30 μg/mL Gentamicina, HS (15%, 10%, 5% e 0%). Raccolta del cervello Poco prima di iniziare la coltura, aggiungere 1,1 mL di mezzo di coltura ad ogni pozzo della piastra a 6 potte con pipetta P1000 e posizionarlo a 37 °C. Posizionare tutte le apparecchiature (microscopio a dissezione, elicottero tissutale, lampada di sezionamento, utensili di sezionatura, elettrodi, piastre, inserti e carte filtranti) all’interno dell’armadio di sicurezza biologico e sterilizzare sotto la luce UV per 15 minuti. Regolare lo spessore della fetta a 350 μm. Ritirare il GBSS dal frigo. Aggiungere 5 mL di GBSS a sei piastre di Petri. Saranno necessari sei piatti petri per animale. Eutanasia il cucciolo di topo. Eseguire la decapitazione usando una forbice affilata alla base del tronco encefalico dell’animale. Lavare la testa dell’animale tre volte in GBSS freddo e prenderla all’interno dell’armadio di sicurezza. Isolamento tissutale e preparazione delle fette Inserire saldamente forcep affilate nelle orbite degli occhi per tenere la testa. Usando una forbice sottile tagliare la pelle / cuoio capelluto lungo la linea mediana a partire dal forame vertebrale verso i lobi frontali e metterlo da parte. Tagliare allo stesso modo il cranio e lungo la fessura trasversale cerebrale (spazio tra cervello e cervelletto). Con le lunghe forcep curve, allontanalo. Scartare i bulbi olfattivi con una spatola. Rimuovere il cervello dalla testa e posizionarlo in GBSS ghiacciato con la superficie dorsale di fronte (Figura 1A). Inserire le forcep sottili nel cervelletto e percorrere la linea mediana con la spatola che apre ogni emisfero con molta attenzione(Figura 1B). Con forcelle curve corte, rimuovere con cura il tessuto in eccesso che copre gli ippocampi, senza toccare la struttura ippocampale. Quindi, con una spatola, tagliare sotto ogni ippocampo(Figura 1C). Prendi un emisfero e posizionalo, con l’ippocampo rivolto verso l’alto, su una carta da filtro. Ripetere la procedura con l’altro emisfero e posizionarla parallelamente alla prima, nella carta filtrante. Mettere la carta filtrante sull’elicottero tissutale, con gli emisferi perpendicolari alla lama, e tagliare gli emisferi in fette da 350 μm(Figura 1D). Posizionare il tessuto affettato in una piastra di Petri con GBSS freddo (Figura 1E). Separare accuratamente le fette utilizzando gli elettrodi a punta rotonda(Figura 1F). Conservare solo le fette con una corteccia rinale strutturalmente intatta e ippocampo. Le aree DG e CA dovrebbero essere perfettamente definite, così come la corteccia entorinale e perichinale(figura 1G). Posizionare ogni fetta sull’inserto(Figura 1H-I), con una spatola e un elettrodo a punta rotonda. Rimuovere il mezzo di dissezione in eccesso intorno a ogni fetta con una pipetta P20 (Figura 1J). Quattro fette rhinal cortex-ippocampo possono essere coltivate in un unico inserto (Figura 1K). Manutenzione della cultura Cambia il mezzo a giorni dall’altra. Riscaldare il mezzo a 37 °C. Prendi i piatti dall’incubatrice. Raccogliere ogni inserto tenendo il bordo di plastica con le forcep(Figura 1L). Utilizzare una mano libera per aspirare il mezzo dal pozzo. Riposizionare l’inserto nel pozzo e aggiungere 1 mL, con una pipetta P1000, di mezzo fresco riscaldato(Figura 1M). Ripetere per tutti gli inserti. Assicurarsi che nessuna bolla d’aria sia intrappolata tra la membrana e il mezzo. NOTA: Le fette epilettiche subiscono una graduale e controllata privazione del siero nel mezzo. Da 9 giorni in vitro (DIV) in su, le fette vengono mantenute in NBA senza HS14. Figura 1: Procedura dettagliata per la preparazione delle fette organotipiche della corteccia renale-ippocampo. (A) Rimuovere il cervello dalla testa e posizionarelo in GBSS ghiacciato con la superficie dorsale di fronte. (B) Inserire le forcep nel cervelletto. Aprire il cervello attraverso la linea mediana e rimuovere il tessuto in eccesso sopra l’ippocampo. (C) Con una spatola tagliata sotto l’ippocampo, come indicato dalle frecce. (D) Posizionare entrambi gli ippocampi rivolti verso l’alto e paralleli l’uno all’altro sulla carta filtrante e tagliare 350 μm di fette sull’elicottero tissutale. (E) Posizionare l’ippocampo affettato in GBSS ghiacciato. (F) Separare le fette con l’aiuto di elettrodi di vetro a punta rotonda. (G) Scegli solo le fette che raffigurano una corteccia rinale intatta e un ippocampo. (H, I) Con l’aiuto di un elettrodo di vetro rotondo a punta spingere ogni fetta sulla spatola e posizionarla sull’inserto. (J) Rimuovere il GBSS che circonda la sezione. (K) Posizionare quattro fette per inserto. (L) Per cambiare il mezzo, sollevare l’inserto e aspirare il mezzo con una pipetta di vetro. (M) Aggiungere un mezzo fresco posizionando la pipetta tra l’inserto e le pareti della piastra a 6 pozzatti. Assicurarsi che non ci siano bolle d’aria sotto le fette. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 2. Registrazioni elettrofisioiche NOTA: Le registrazioni elettrofisiotiche sono state eseguite in fette organotipiche corteccia-ippocampo rhinal a 7, 14 e 21 DIV in una camera di tipo interfaccia. Le registrazioni sono state ottenute con un amplificatore, digitalizzate e analizzate con software. Tutte le registrazioni erano filtrate a banda (filtro bessel a otto poli a 60 Hz e filtro gaussiano a 600 Hz). Preparazione dell’installazione Preparare 50 mL di mezzo NBA con 1 mL di B27 e 250 μL di L-glutammina. Riscaldarsi a 37 °C. Impostare la configurazione dell’elettrofisiologia in circuito chiuso. Verificare se la portata è di 2 mL/min. Aprire la valvola carbox (5% CO2/95% O2) e controllare il livello dell’acqua nel sistema. Mettere la carta filtrante nella camera di registrazione dell’interfaccia per drenare il mezzo in eccesso e la carta per la pulizia dell’obiettivo sotto il telaio per fornire il mezzo alla fetta. Accendere il regolatore di temperatura, gli amplificatori e il micromanipolatore. Lasciare che la temperatura nella camera di interfaccia si stabilizzi a 37 °C prima di iniziare le registrazioni. Preparare il liquido cerebrospinale artificiale (aCSF: 124 mM NaCl, 3mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 10 mM di glucosio, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 con pH 7,4) e utilizzarlo per riempire l’elettrodo di vetro con una siringa. Posizionarlo nell’elettrodo ricevente. Registrazioni di attività spontanea Una volta che la temperatura è stabile, rimuovere la piastra dall’incubatore e tagliare una fetta dall’inserto con una lama altamente affilata. Posizionarlo in una piastra da 60 mm con una goccia di mezzo. Portalo alla camera di registrazione dell’interfaccia. Posizionare la fetta nella camera di interfaccia con l’ippocampo in basso a destra. Posizionare l’elettrodo ricevente nello strato cellulare piramidale CA3. Procedere al protocollo di acquisizione continua e registrare per 30 min. 3. Dosaggio dell’assorbimento PI NOTA: La morte cellulare è stata valutata monitorando l’assorbimento cellulare dello ioduro di propidio colorante fluorescente (PI). PI è un composto polare, che entra in cellule con membrane cellulari danneggiate e interagisce con il DNA emettendo fluorescenza rossa (assorbanza 493 nm, emissione 630 nm). Poiché PI non è permeante per le cellule vive, viene utilizzato per rilevare le cellule morte in una popolazione. Incubazione PI Preparare, nel terreno di coltura, una fresca diluizione 1:10 dello stock PI. Per il test di assorbimento PI rimuovere la piastra dall’incubatore e sollevare con cura l’inserto. Aggiungere 13 μL di PI al mezzo, con una pipetta P20, ottenendo una concentrazione finale di 2 μM.  Agitare lentamente la piastra prima di rimettere l’inserto in posizione. Assicurati che non ci siano bolle sotto le fette. Rimettere le fette nell’incubatore a 37 °C per 2 ore. Procedere con il protocollo immunoistochimica, come descritto nella sezione successiva. Coprire le piastre con alluminio, poiché PI è sensibile alla luce. 4. Immunoistochimica NOTA: Nell’immunoistochimica sono stati utilizzati un anticorpo specifico neuronale, nonché anticorpi in grado di discriminare fenotipi a riposo e reattivi di microglia e astrociti, per valutare l’estensione della morte neuronale e della gliosi nelle fette organotipiche simili alla corteccia rinale-ippocampo. Fissazione dei tessuti Rimuovere la piastra dall’incubatore e aspirare il mezzo. Fissare le fette con paraformaldeide al 4% (PFA) per 1 h a RT, aggiungendo 1 mL di PFA sotto e sopra le fette, con una pipetta P1000. Rimuovere il PFA e aggiungere 1 mL di PBS. Aggiungere anche PBS sotto e sopra le fette. Mantenere le fette a 4 °C, in PBS, fino a un ulteriore utilizzo. Mettere sempre il parafilm intorno alle piastre per evitare l’asciugatura. Fasi di immunosottenzione Lavare due volte, 10 minuti ogni volta, con 1 mL di PBS. Preparare la soluzione di permeabilizzazione/blocco contenente 1% Triton-X100, 10% HS e 10% BSA in PBS. Preparare la soluzione BSA al 5%. Disegnare due rettangoli con la penna idrofobica (Figura 2A). Tagliare le fette dall’inserto (Figura 2B) con una lama molto affilata. Mettere due fette per diapositiva (Figura 2C) e aggiungere 140 μL di soluzione di permeabilizzazione/blocco sulla parte superiore di ogni fetta, utilizzando una pipetta P200. Incubare per 3 ore presso RT. Diluire gli anticorpi primari alla diluizione di lavoro nel 5% di BSA in PBS. Incubare con gli anticorpi primari durante la notte a 4 °C. Incubare con gli anticorpi secondari per 4 ore a RT. Da questo passaggio, proteggere la piastra dalla luce poiché si stanno lavorando fluorofori. Posizionare una goccia di 50 μL di soluzione hoechst sulla parte superiore di ogni fetta e incubare per 20 minuti a RT. Lavare tra le incubazioni. Lavare sempre tre volte, per 10 minuti ogni volta, con PBS-T. Rimuovere Hoechst e lavare come raccomandato. Aggiungere 50 μL di mezzo di montaggio sulla parte superiore di ogni fetta. Coprire con un copriscivolo in vetro e circondarlo con smalto (Figura 2D). Lasciare asciugare a RT per 24 ore. Visualizza l’immunostaining al microscopio confocale. Mantenere le fette macchiate a -20 °C. Figura 2: Procedura specifica per il saggio di immunoistochimica. (A) Con la penna idrofobica disegnare due quadrati nello scivolo. (B) Tagliare il pezzo di inserto che contiene la fetta. (C) Posizionare ogni fetta nei quadrati disegnati con la penna idrofobica e avviare la fase di permeabilizzazione/blocco. (D) Dopo aver concluso il protocollo, finire montando le fette in mezzo di montaggio, coprendo con un copripavimenti in vetro e circondandolo con smalto per unghie. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.