Een model van epileptogenese in rhinale cortex-hippocampus organotypische plakculturen

De Portugese wetgeving en richtsnoeren van de Europese Unie (2010/63/EU) werden nageleefd in alle procedures met betrekking tot de bescherming van dieren voor wetenschappelijke doeleinden. Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Instellingsorgaan voor dierenwelzijn (ORBEA-iMM) van de iMM en de nationale bevoegde autoriteit (DGAV – Direção Geral de Alimentação e Veterinária). 1. Bereiding van rhinale cortex-hippocampus plakjes OPMERKING: De bereiding van rhinale cortex-hippocampus plakjes maakt gebruik van P6-7 Sprague-Dawley ratten. Cultuuropstelling en medium voorbereiding Bereid op de dag voor de cultuur de vereiste media voor en plaats ze op 4 °C. Bereid dissectiemedium: 25 mM glucose in Gey’s Balanced Salt Solution (GBSS). Bereid kweekmedium voor: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% Paardenserum (HS), 25 mM glucose, 30 μg/ml Gentamycine. Bereid onderhoudsmedium voor: Neurobasal-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-glutamine, 30 μg/ml Gentamycine, HS (15%, 10%, 5% en 0%). Het oogsten van hersenen Voeg vlak voor het begin van de cultuur 1,1 ml cultuurmedium toe aan elke put van de 6-putplaat met een P1000-pipet en plaats deze op 37 °C. Plaats alle apparatuur (dissectiemicroscoop, weefselhelikopter, ontleedlamp, ontledingsgereedschap, elektroden, platen, inzetstukken en filterpapier) in de biologische veiligheidskast en steriliseer gedurende 15 minuten onder UV-licht. Pas de dikte van de plak aan op 350 μm. Haal de GBSS uit de koelkast. Voeg 5 ml GBSS toe aan zes petrischalen. Per dier zijn zes Petrischalen nodig. Euthanaseer de ratten pup. Voer onthoofding uit met behulp van een scherpe schaar aan de basis van de hersenstam van het dier. Was de dierenkop drie keer in koude GBSS en neem deze mee in de veiligheidskast. Weefselisolatie en bereiding van plakjes Steek de scherpe tang stevig in de oogkassen om het hoofd vast te houden. Knip met een dunne schaar de huid/hoofdhuid langs de middellijn vanaf de wervels naar de frontale kwabben en leg deze opzij. Snijd op dezelfde manier de schedel en langs de cerebrale transversale spleet (ruimte tussen hersenen en cerebellum). Met gebogen lange tang, verplaats het uit elkaar. Gooi de olfactorische bollen weg met een spatel. Verwijder de hersenen van het hoofd en plaats het in ijskoude GBSS met het dorsale oppervlak naar boven (Figuur 1A). Steek de fijne tang in het cerebellum en ga langs de middellijn met de spatel die elke hemisfeer heel voorzichtig opent (Figuur 1B). Verwijder met korte curve forceps voorzichtig het overtollige weefsel dat de hippocampi bedekt, zonder de hippocampale structuur aan te raken. Snijd vervolgens met een spatel onder elke hippocampus (figuur 1C). Pak een hemisfeer en plaats deze, met hippocampus naar boven, op een filterpapier. Herhaal de procedure met de andere hemisfeer en plaats deze parallel aan de eerste, in het filterpapier. Leg het filterpapier op de weefselhelikopter, met de hemisferen loodrecht op het mes, en snijd de hemisferen in plakjes van 350 μm (figuur 1D). Doe het gesneden weefsel in een petrischaaltje met koude GBSS (figuur 1E). Scheid de plakjes voorzichtig met behulp van de elektroden met ronde punt (Afbeelding 1F). Bewaar alleen de plakjes met een structureel intacte rhinale cortex en hippocampus. DG- en CA-gebieden moeten perfect worden gedefinieerd, evenals de entorhinale en perirhinale cortex (figuur 1G). Plaats elk plakje op het inzetstuk (afbeelding 1H-I), met een spatel en een ronde tipelektrode. Verwijder het overtollige dissectiemedium rond elk segment met een P20-pipet (figuur 1J). Vier rhinale cortex-hippocampus plakjes kunnen worden gekweekt in een enkele insert (Figuur 1K). Cultuuronderhoud Verander het medium om de andere dag. Warm het medium op bij 37 °C. Haal de platen uit de couveuse. Pak elk inzetstuk op door de plastic rand met een tang vast te houden (figuur 1L). Gebruik een vrije hand om het medium uit de put te aspireren. Plaats het inzetstuk terug in de put en voeg 1 ml, met een P1000 pipet, van vers opgewarmd medium toe (Afbeelding 1M). Herhaal dit voor alle wisselplaten. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen het membraan en het medium zitten. OPMERKING: Epileptische plakjes ondergaan een geleidelijke en gecontroleerde deprivatie van serum in het medium. Vanaf 9 Days In Vitro (DIV) worden slices onderhouden in NBA zonder HS14. Figuur 1: Gedetailleerde procedure voor de bereiding van rhinale cortex-hippocampus organotypische plakjes. (A) Verwijder de hersenen van het hoofd en plaats het in ijskoude GBSS met het dorsale oppervlak naar boven. (B) Steek de tang in het cerebellum. Open de hersenen door de middellijn en verwijder het overtollige weefsel over de hippocampus. (C) Met een spatel onder de hippocampus gesneden, zoals aangegeven door de pijlen. (D) Plaats beide hippocampi naar boven en evenwijdig aan elkaar op het filterpapier en snijd 350 plakjes van μm op de tissue chopper. (E) Plaats de gesneden hippocampus in ijskoude GBSS. (F) Scheid de plakjes met behulp van ronde glaselektroden. (G) Kies alleen de plakjes die een intacte rhinale cortex en hippocampus weergeven. (H, I) Duw met behulp van een ronde glazen elektrode elk plakje naar de spatel en plaats het op het inzetstuk. (J) Verwijder de GBSS rondom het segment. (K) Plaats vier plakjes per inzetstuk. (L) Om het medium te vervangen, tilt u het inzetstuk op en aspireert u het medium met een glazen pipet. (M) Voeg een vers medium toe door de pipet tussen het inzetstuk en de wanden van de 6-wells plaat te plaatsen. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder de plakjes zitten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. 2. Elektrofysiologische opnames OPMERKING: Elektrofysiologische opnames werden uitgevoerd in rhinale cortex-hippocampus organotypische plakjes op 7, 14 en 21 DIV in een interface-achtige kamer. Opnames werden verkregen met een versterker, gedigitaliseerd en geanalyseerd met software. Alle opnamen werden band-pass gefilterd (achtpolig Bessel-filter bij 60 Hz en Gaussiaans filter bij 600 Hz). Voorbereiding van de installatie Bereid 50 ml NBA-medium voor met 1 ml B27 en 250 μL L-Glutamine. Opwarmen bij 37 °C. Stel de elektrofysiologie-instelling in een nauw circuit in. Controleer of het debiet 2 ml/min is. Open de carbox (5% CO2/95% O2)klep en controleer het waterniveau in het systeem. Plaats het filterpapier in de interface-opnamekamer om overtollig medium af te tappen en het lensreinigingspapier onder het frame om medium naar het segment te leveren. Schakel de temperatuurregelaar, de versterkers en de micromanipulator in. Laat de temperatuur in de interfacekamer stabiliseren bij 37 °C voordat u de opnames start. Bereid kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF: 124 mM NaCl, 3mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4,25 mM NaHCO3,10 mM glucose, 2 mM CaCl2,1 mM MgSO4 met pH 7,4) en gebruik het om de glaselektrode met een spuit te vullen. Plaats het in de ontvangende elektrode. Opnames van spontane activiteit Zodra de temperatuur stabiel is, verwijdert u de plaat uit de incubator en snijdt u een plak uit het inzetstuk met een zeer scherp mes. Plaats het in een plaat van 60 mm met een druppel medium. Breng het naar de interface opnamekamer. Plaats het plakje in de interfacekamer met de hippocampus rechtsonder. Plaats de ontvangende elektrode in de CA3-piramidevormige cellaag. Ga verder met het continue acquisitieprotocol en noteer gedurende 30 minuten. 3. PI-opnametest OPMERKING: Celdood werd beoordeeld door de cellulaire opname van de fluorescerende kleurstof propidiumjodide (PI) te controleren. PI is een polaire verbinding, die cellen met beschadigde celmembranen binnendringt en interageert met DNA dat rode fluorescentie uitzendt (absorptie 493 nm, emissie 630 nm). Omdat PI niet permeant is voor levende cellen, wordt het gebruikt om dode cellen in een populatie te detecteren. PI incubatie Bereid in kweekmedium een verse 1:10 verdunning van PI-bouillon. Verwijder voor pi-opnametest de plaat uit de incubator en til de inzet voorzichtig op. Voeg 13 μL PI toe aan het medium, met een P20 pipet, met een eindconcentratie van 2 μM.  Roer de plaat langzaam voordat u de inzet weer op zijn plaats zet. Zorg ervoor dat er geen bubbels onder de plakjes zitten. Doe de plakjes 2 uur terug in de incubator van 37 °C. Ga verder met het immunohistochchemieprotocol, zoals beschreven in de volgende sectie. Bedek de platen met aluminium, omdat PI lichtgevoelig is. 4. Immunohistochie OPMERKING: In de immunohistochie werden een neuronspecifiek antilichaam, evenals antilichamen die rust- en reactieve fenotypen van microglia en astrocyten kunnen discrimineren, gebruikt om de uitbreiding van neuronale dood en gliose in rhinale cortex-hippocampus epileptische organotypische plakjes te evalueren. Weefselfixatie Haal de plaat uit de incubator en aspireer het medium. Bevestig de plakjes met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 1 uur bij RT, door 1 ml PFA onder en boven de plakjes toe te voegen, met een P1000 pipet. Verwijder de PFA en voeg 1 ml PBS toe. Voeg ook PBS toe onder en boven de segmenten. Bewaar de plakjes op 4 °C, in PBS, tot verder gebruik. Plaats altijd parafilm rond de platen om uitdroging te voorkomen. Immunostaining stappen Was tweemaal, telkens 10 min, met 1 ml PBS. Bereid permeabilisatie/blokkeeroplossing voor met 1% Triton-X100, 10% HS en 10% BSA in PBS. Bereid 5% BSA-oplossing voor. Teken twee rechthoeken met de hydrofobe pen (Figuur 2A). Snijd de plakjes uit de wisselplaat (afbeelding 2B) met een zeer scherp mes. Leg twee plakjes per dia (figuur 2C) en voeg 140 μL permeabilisatie/blokkeeroplossing toe aan de bovenkant van elk segment, met behulp van een P200 pipet. Incubeer gedurende 3 uur bij RT. Verdun de primaire antilichamen tegen de werkverdunning in 5% BSA in PBS. Incubeer ‘s nachts met de primaire antilichamen bij 4 °C. Incubeer met de secundaire antilichamen gedurende 4 uur bij RT. Bescherm vanaf deze stap de plaat tegen licht, omdat er met fluoroforen wordt gewerkt. Leg een druppel Van Hoechst van 50 μL op de bovenkant van elke plak en incubeer gedurende 20 minuten bij RT. Wassen tussen incubaties. Was altijd drie keer, telkens 10 minuten, met PBS-T. Verwijder Hoechst en was zoals aanbevolen. Voeg 50 μL montagemedium toe aan de bovenkant van elk plakje. Dek af met een glazen hoeslip en omring met nagellak (Afbeelding 2D). Laat het 24 uur drogen bij RT. Visualiseer de immunostaining onder een confocale microscoop. Bewaar de bevlekte plakjes op -20 °C. Figuur 2: Specifieke procedure voor de immunohistochistry assay. (A) Teken met de hydrofobe pen twee vierkanten in de glijbaan. (B) Snijd het stuk inzetstuk dat het segment bevat. (C) Plaats elk plakje in de vierkanten getekend met de hydrofobe pen en start de permeabilisatie/blokkeerstap. (D) Na het afsluiten van het protocol, eindig door de plakjes in montagemedium te monteren, af te dekken met een glazen afdeklip en deze te omringen met nagellak. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.