Un modèle d’épileptogenèse dans les cultures de tranches organotypiques cortex rhinal-hippocampe

La législation portugaise et les lignes directrices de l’Union européenne (2010/63/UE) ont été respectées dans toutes les procédures relatives à la protection des animaux à des fins scientifiques. Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’organisme institutionnel de protection des animaux (ORBEA-iMM) de l’iMM et l’autorité nationale compétente (DGAV – Direção Geral de Alimentação e Veterinária). 1. Préparation des tranches de cortex-hippocampe rhinal REMARQUE: La préparation des tranches de cortex rhinal-hippocampe utilise des rats P6-7 Sprague-Dawley. Installation de la culture et préparation du milieu La veille de la culture, préparez les supports requis et placez-les à 4 °C. Préparer le milieu de dissection : 25 mM de glucose dans la solution saline équilibrée (SGBD) de Gey. Milieu de culture préparé : 50 % d’Opti-MEM, 25 % de SHSH, 25 % de sérum de cheval (SH), 25 mM de glucose, 30 μg/mL de gentamycine. Préparer le milieu d’entretien : Neurobasal-A (NBA), 2 % de B27, 1 mM de L-glutamine, 30 μg/mL de gentamycine, HS (15 %, 10 %, 5 % et 0 %). Récolte du cerveau Juste avant de commencer la culture, ajouter 1,1 mL de milieu de culture à chaque puits de la plaque de 6 puits avec une pipette P1000 et la placer à 37 °C. Placez tout l’équipement (microscope de dissection, hachoir à tissus, lampe de dissection, outils de dissection, électrodes, plaques, inserts et papiers filtrants) à l’intérieur de l’armoire de sécurité biologique et stérilisez sous lumière UV pendant 15 minutes. Ajustez l’épaisseur de la tranche à 350 μm. Retirez le SGBD du réfrigérateur. Ajouter 5 mL de SGBD à six boîtes de Pétri. Six boîtes de Pétri seront nécessaires par animal. Euthanasier le chiot rat. Effectuez la décapitation à l’aide d’un ciseau tranchant à la base du tronc cérébral de l’animal. Lavez la tête de l’animal trois fois dans un SGBD froid et emportez-la à l’intérieur de l’armoire de sécurité. Isolement tissulaire et préparation de tranches Insérez fermement des pinces tranchantes dans les orbites pour maintenir la tête. À l’aide d’un mince ciseau, coupez la peau / le cuir chevelu le long de la ligne médiane à partir du foramen vertébral vers les lobes frontaux et mettez-le de côté. Couper de la même manière le crâne et le long de la fissure transversale cérébrale (espace entre le cerveau et le cervelet). Avec de longues pinces incurvées, séparez-la. Jetez les bulbes olfactifs avec une spatule. Retirez le cerveau de la tête et placez-le dans un SGBD glacé avec la surface dorsale vers le haut (Figure 1A). Insérez la pince fine dans le cervelet et suivez la ligne médiane avec la spatule ouvrant chaque hémisphère très soigneusement(Figure 1B). Avec une pince à courbe courte, retirez soigneusement l’excès de tissu qui recouvre l’hippocampe, sans toucher la structure de l’hippocampe. Puis avec une spatule, coupé sous chaque hippocampe (Figure 1C). Prenez un hémisphère et placez-le, avec l’hippocampe tourné vers le haut, sur un papier filtre. Répétez la procédure avec l’autre hémisphère et placez-la parallèlement au premier, dans le papier filtre. Placez le papier filtre sur le hachoir à tissus, les hémisphères perpendiculaires à la lame, et coupez les hémisphères en tranches de 350 μm(figure 1D). Placer le tissu tranché dans une boîte de Petri avec du SGBD froid(figure 1E). Séparez soigneusement les tranches à l’aide des électrodes de pointe rondes(Figure 1F). Ne conservez que les tranches avec un cortex rhinal et un hippocampe structurellement intacts. Les zones DG et CA doivent être parfaitement définies, ainsi que le cortex entorhinal et perirhinal (Figure 1G). Placez chaque tranche sur l’insert(figure 1H-I),à l’aide d’une spatule et d’une électrode à pointe ronde. Enlevez l’excès de milieu de dissection autour de chaque tranche à l’aide d’une pipette P20(figure 1J). Quatre tranches de cortex-hippocampe rhinal peuvent être cultivées en un seul insert(figure 1K). Maintien de la culture Changez le support tous les deux jours. Réchauffer le milieu à 37 °C. Prenez les assiettes de l’incubateur. Ramassez chaque insert en maintenant le bord en plastique avec une pince(Figure 1L). Utilisez une main libre pour aspirer le milieu à partir du puits. Replacer l’insert dans le puits et ajouter 1 mL, à l’aide d’une pipette P1000, de milieu frais chauffé(figure 1M). Répétez l’opération pour toutes les insertions. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est emprisonnée entre la membrane et le milieu. REMARQUE: Les tranches de type épileptique subissent une privation progressive et contrôlée de sérum dans le milieu. À partir de 9 jours in vitro (DIV), les tranches sont maintenues en NBA sans HS14. Ill. 1 : Procédure détaillée pour la préparation de tranches organotypiques cortex-hippocampe rhinal. (A) Retirez le cerveau de la tête et placez-le dans un SGBD glacé avec la surface dorsale vers le haut. (B) Insérez la pince dans le cervelet. Ouvrez le cerveau par la ligne médiane et retirez l’excès de tissu au-dessus de l’hippocampe. (C) Avec une spatule coupée sous l’hippocampe, comme indiqué par les flèches. (D) Placez les deux hippocampes face vers le haut et parallèles l’un à l’autre sur le papier filtre et coupez des tranches de 350 μm sur le hachoir à tissus. (E) Placer l’hippocampe tranché dans un SGBD glacé. (F) Séparer les tranches à l’aide d’électrodes de verre à bout rond. (G) Choisissez uniquement les tranches qui représentent un cortex rhinal et un hippocampe intacts. (H, I) À l’aide d’une électrode de verre à bout rond, poussez chaque tranche vers la spatule et placez-la sur l’insert. (J) Supprimez le SGBD entourant la tranche. (K) Placez quatre tranches par insert. (L) Pour changer le milieu, soulevez l’insert et aspirez le milieu avec une pipette en verre. (M) Ajouter un milieu frais en plaçant la pipette entre l’insert et les parois de la plaque de 6 puits. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air sous les tranches. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. 2. Enregistrements électrophysiologiques REMARQUE: Des enregistrements électrophysiologiques ont été exécutés dans les tranches organotypiques rhinal de cortex-hippocampe à 7, 14 et 21 DIV dans une chambre d’interface-type. Les enregistrements ont été obtenus avec un amplificateur, numérisés et analysés avec un logiciel. Tous les enregistrements ont été filtrés par passe-bande (filtre de Bessel à huit pôles à 60 Hz et filtre gaussien à 600 Hz). Préparation de l’installation Préparer 50 mL de milieu NBA avec 1 mL de B27 et 250 μL de L-Glutamine. Réchauffer à 37 °C. Réglez la configuration d’électrophysiologie en circuit étroit. Vérifiez si le débit est de 2 mL/min. Ouvrez la vanne de la boîte à voiture(5 CO 2 / 95% O2)et vérifiez le niveau d’eau dans le système. Placez le papier filtre dans la chambre d’enregistrement de l’interface pour drainer l’excès de support et le papier de nettoyage de la lentille sous le cadre pour fournir du support à la tranche. Allumez le régulateur de température, les amplificateurs et le micromanipulateur. Laissez la température dans la chambre d’interface se stabiliser à 37 °C avant de commencer les enregistrements. Préparer du liquide céphalorachidien artificiel (aCSF : NaCl 124 mM, KCl 3mM, 1,2 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 10 mM de glucose, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 avec pH 7,4) et l’utiliser pour remplir l’électrode de verre avec une seringue. Placez-le dans l’électrode de réception. Enregistrements d’activité spontanée Une fois la température stable, retirez la plaque de l’incubateur et coupez une tranche de l’insert avec une lame très tranchante. Placez-le dans une plaque de 60 mm avec une goutte de milieu. Amenez-le à la chambre d’enregistrement de l’interface. Placez la tranche dans la chambre d’interface avec l’hippocampe en bas à droite. Placez l’électrode réceptrice dans la couche de cellules pyramidales CA3. Passez au protocole d’acquisition continue et enregistrez pendant 30 min. 3. Essai d’absorption de PI REMARQUE : La mort cellulaire a été évaluée en surveillant l’absorption cellulaire de l’iodure de propidium (IP), colorant fluorescent. PI est un composé polaire, qui pénètre dans les cellules avec des membranes cellulaires endommagées et interagit avec l’ADN émettant la fluorescence rouge (absorbance 493 nm, émission 630 nm). Puisque l’IP n’est pas perméant aux cellules vivantes, il est employé pour détecter des cellules mortes dans une population. Incubation de l’IP Préparer, dans un milieu de culture, une dilution fraîche de 1:10 du stock d’IP. Pour le test d’absorption PI, retirez la plaque de l’incubateur et soulevez soigneusement l’insert. Ajouter 13 μL de PI au milieu, à l’aide d’une pipette P20, en obtenant une concentration finale de 2 μM.  Agitez lentement la plaque avant de remettre l’insert en place. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles sous les tranches. Remettez les tranches dans l’incubateur à 37 °C pendant 2 h. Procédez avec le protocole immunohistochemistry, comme décrit dans la section suivante. Couvrez les plaques d’aluminium, car PI est sensible à la lumière. 4. Immunohistochimie REMARQUE: En immunohistochimie, un anticorps spécifique au neurone, ainsi que des anticorps capables de distinguer les phénotypes au repos et réactifs des microglies et des astrocytes, ont été utilisés pour évaluer l’extension de la mort neuronale et de la gliose dans les tranches rhinales cortex-hippocampus épileptique-comme organotypiques. Fixation tissulaire Retirez la plaque de l’incubateur et aspirez le milieu. Fixer les tranches avec du paraformaldéhyde à 4% (PFA) pendant 1 h à TA, en ajoutant 1 mL de PFA sous et au-dessus des tranches, avec une pipette P1000. Retirez le PFA et ajoutez 1 mL de PBS. Ajoutez également pbs sous et au-dessus des tranches. Conserver les tranches à 4 °C, dans du PBS, jusqu’à une utilisation ultérieure. Mettez toujours du parafilm autour des plaques pour éviter le séchage. Étapes d’immunomarquage Laver deux fois, 10 min à chaque fois, avec 1 mL de PBS. Préparer une solution de perméabilisation/blocage contenant 1 % de Triton-X100, 10 % de SH et 10 % de BSA dans du PBS. Préparez une solution BSA à 5%. Dessinez deux rectangles avec le stylo hydrophobe (Figure 2A). Coupez les tranches de l’insert(Figure 2B)à l’aide d’une lame très tranchante. Mettre deux tranches par lame(figure 2C)et ajouter 140 μL de solution de perméabilisation/blocage sur le dessus de chaque tranche, à l’aide d’une pipette P200. Incuber pendant 3 h à TA. Diluer les anticorps primaires à la dilution de travail dans 5% BSA dans PBS. Incuber avec les anticorps primaires pendant la nuit à 4 °C. Incuber avec les anticorps secondaires pendant 4 h à droite. À partir de cette étape, protégez la plaque de la lumière puisque les fluorophores sont travaillés avec. Placer une goutte de 50 μL de solution de Hoechst sur le dessus de chaque tranche et incuber pendant 20 min à RT. Laver entre les incubations. Toujours laver trois fois, pendant 10 min à chaque fois, avec PBS-T. Retirer Hoechst et laver comme recommandé. Ajouter 50 μL de support de montage sur le dessus de chaque tranche. Couvrir avec une lamelle de couverture en verre et entourer de vernis à ongles (Figure 2D). Laissez sécher à RT pendant 24 h. Visualisez l’immunomarquage sous un microscope confocal. Conservez les tranches colorées à -20 °C. Ill. 2 : Procédure spécifique pour l’essai d’immunohistochimie. (A) Avec le stylo hydrophobe, dessinez deux carrés dans la diapositive. (B) Couper le morceau d’insert qui contient la tranche. (C) Placez chaque tranche dans les carrés dessinés avec le stylo hydrophobe et commencez l’étape de perméabilisation/blocage. (D) Après avoir conclu le protocole, terminer en montant les tranches dans un milieu de montage, en recouvrant d’une lamelle de couverture en verre et en l’entourant de vernis à ongles. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.