Un Modelo De Epileptogénesis En La Corteza Rinal-Hipocampo Organotípica Slice Cultivos

La legislación portuguesa y las directrices de la Unión Europea (2010/63/UE) se respetaron en todos los procedimientos relativos a la protección de los animales con fines científicos. Todos los métodos aquí descritos fueron aprobados por el Organismo Institucional de Bienestar Animal (ORBEA-iMM) de la IMM y la autoridad nacional competente (DGAV – Direção Geral de Alimentação e Veterinária). 1. Preparación de rodajas de corteza rinal-hipocampo NOTA: La preparación de las rebanadas de la corteza rinal-hipocampo utiliza ratas P6-7 Sprague-Dawley. Configuración de la cultura y preparación del medio El día antes de la cultura, preparar los medios requeridos y colocarlos a 4 °C. Preparar el medio de disección: 25 mM de glucosa en la solución salina balanceada de Gey (GBSS). Preparar medio de cultivo: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% Suero de Caballo (HS), 25 mM de glucosa, 30 μg/mL de Gentamicina. Preparar medio de mantenimiento: Neurobasal-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-glutamina, 30 μg/mL Gentamicina, HS (15%, 10%, 5% y 0%). Cosecha del cerebro Justo antes de comenzar el cultivo, agregue 1.1 mL de medio de cultivo a cada pozo de la placa de 6 pozos con una pipeta P1000 y colóquele a 37 °C. Coloque todo el equipo (microscopio de disección, helicóptero de tejidos, lámpara de disección, herramientas de disección, electrodos, placas, insertos y papeles de filtro) dentro del gabinete de seguridad biológica y esterilice bajo luz UV durante 15 minutos. Ajuste el grosor de la rebanada a 350 μm. Retire el GBSS de la nevera. Añadir 5 mL de GBSS a seis placas de Petri. Se requerirán seis placas de Petri por animal. Eutanasiar al cachorro de rata. Realizar la decapitación mediante el uso de una tijera afilada en la base del tronco encefálico del animal. Lave la cabeza del animal tres veces en GBSS frío y llévelo dentro del gabinete de seguridad. Aislamiento de tejidos y preparación de rodajas Inserte firmemente las órceps afiladas en las cuencas de los ojos para sostener la cabeza. Usando una tijera delgada cortar la piel / cuero cabelludo a lo largo de la línea media a partir del agujero vertebral hacia los lóbulos frontales y ponerlo a un lado. Cortar de la misma manera el cráneo y a lo largo de la fisura transversal cerebral (espacio entre el cerebro y el cerebelo). Con fórceps largos curvos, muévalo aparte. Deseche los bulbos olfativos con una espátula. Retire el cerebro de la cabeza y colóquelo en el SGB helado con la superficie dorsal hacia arriba (Figura 1A). Inserte las fórceps finas en el cerebelo y vaya a lo largo de la línea media con la espátula abriendo cada hemisferio con mucho cuidado (Figura 1B). Con fórceps de curva corta, retire cuidadosamente el exceso de tejido que cubre el hipocampo, sin tocar la estructura del hipocampo. Luego con una espátula, cortar debajo de cada hipocampo (Figura 1C). Coge un hemisferio y colótalo, con el hipocampo hacia arriba, sobre un papel de filtro. Repita el procedimiento con el otro hemisferio y colólelo paralelo al primero, en el papel de filtro. Ponga el papel de filtro en el helicóptero de tejido, con los hemisferios perpendiculares a la hoja, y corte los hemisferios en rodajas de 350 μm (Figura 1D). Coloque el tejido cortado en rodajas en una placa de Petri con GBSS frío (Figura 1E). Separe cuidadosamente las rebanadas utilizando los electrodos de punta redonda(Figura 1F). Mantenga solo las rebanadas con una corteza rinal e hipocampo estructuralmente intactos. Las áreas DG y CA deben estar perfectamente definidas, así como la corteza entorrinal y perirhinal (Figura 1G). Coloque cada rebanada sobre el inserto (Figura 1H-I), con una espátula y un electrodo de punta redonda. Retire el exceso de medio de disección alrededor de cada rebanada con una pipeta P20 (Figura 1J). Cuatro rebanadas de corteza rinal-hipocampo se pueden cultivar en un solo inserto (Figura 1K). Mantenimiento de la cultura Cambie el medio cada dos días. Calentar el medio a 37 °C. Tome los platos de la incubadora. Recoja cada inserto sosteniendo el borde de plástico con fórceps (Figura 1L). Utilice una mano libre para aspirar el medio del pozo. Colocar el inserto de nuevo en el pozo y añadir 1 mL, con una pipeta P1000, de medio fresco calentado (Figura 1M). Repita el tiempo para todas las inserciones. Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas entre la membrana y el medio. NOTA: Epiléptico-como las rebanadas experimentan una privación gradual y controlada del suero en el medio. A partir de los 9 días in vitro (DIV), las rebanadas se mantienen en NBA sin HS14. Figura 1: Procedimiento detallado para la preparación de rodajas organotípicas de corteza rinal-hipocampo. (A) Retire el cerebro de la cabeza y colóquelo en el SGB helado con la superficie dorsal hacia arriba. (B) Inserte los fórceps en el cerebelo. Abra el cerebro a través de la línea media y elimine el exceso de tejido sobre el hipocampo. (C) Con una espátula cortada debajo del hipocampo, como lo indican las flechas. (D) Coloque ambos hipocampos hacia arriba y paralelos entre sí en el papel de filtro y corte las rodajas de 350 μm en el helicóptero de tejidos. (E) Coloque el hipocampo en rodajas en GBSS helado. (F) Separe las rebanadas con la ayuda de electrodos de vidrio con punta redonda. (G) Elija sólo las rebanadas que representan una corteza rinal intacta y el hipocampo. (H, I) Con la ayuda de un electrodo de vidrio con punta redonda empuje cada rebanada a la espátula y colóquela en el inserto. (J) Quite el GBSS que rodea el segmento. (K) Colocar cuatro rodajas por inserto. (L) Para cambiar el medio, levante el inserto y aspire el medio con una pipeta de vidrio. (M)Añadir medio fresco colocando la pipeta entre el inserto y las paredes de la placa de 6 pozos. Asegúrese de que no haya burbujas de aire debajo de las rebanadas. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura. 2. Grabaciones electrofisiológicas NOTA: Las grabaciones electrofisiológicas fueron realizadas en rebanadas organotípicas de la corteza-hipocampo rhinal en 7, 14 y 21 DIV en un interfaz-tipo compartimiento. Las grabaciones se obtuvieron con un amplificador, se digitalizaron y analizaron con software. Todas las grabaciones fueron filtradas por paso de banda (filtro Bessel de ocho polos a 60 Hz y filtro gaussiano a 600 Hz). Preparación del programa de instalación Preparar 50 mL de medio NBA con 1 mL de B27 y 250 μL de L-Glutamina. Calentar a 37 °C. Establezca la configuración de electrofisiología en circuito cerrado. Verifique si el caudal es de 2 mL/min. Abra la válvula carbox (5% CO2/95% O2)y compruebe el nivel de agua en el sistema. Coloque el papel de filtro en la cámara de grabación de la interfaz para drenar el exceso de medio y el papel de limpieza de la lente debajo del marco para suministrar el medio a la rebanada. Encienda el controlador de temperatura, los amplificadores y el micromanipulador. Deje que la temperatura en la cámara de interfaz se estabilice a 37 °C antes de iniciar las grabaciones. Preparar líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF: 124 mM NaCl, 3mM KCl, 1.2 mM NaH2PO4,25 mM NaHCO3,10 mM glucosa, 2 mM CaCl2,1 mM MgSO4 con pH 7.4) y utilizarlo para llenar el electrodo de vidrio con una jeringa. Colótelo en el electrodo receptor. Registros de actividad espontánea Una vez que la temperatura sea estable, retire la placa de la incubadora y corte una rebanada del inserto con una cuchilla muy afilada. Colóquelo en una placa de 60 mm con una gota de medio. Llébalo a la cámara de grabación de la interfaz. Coloque la rebanada en la cámara de interfaz con el hipocampo en la parte inferior derecha. Coloque el electrodo receptor en la capa de celda piramidal CA3. Proceder al protocolo de adquisición continua y grabar durante 30 min. 3. Ensayo de absorción de PI NOTA: La muerte celular fue evaluada supervisando la absorción celular del yoduro fluorescente del propidium del tinte (pi). El PI es un compuesto polar, que entra en las células con las membranas celulares dañadas e interactúa con el ADN emitiendo fluorescencia roja (absorbancia 493 nm, emisión 630 nm). Dado que el PI no es permeante a las células vivas, se utiliza para detectar células muertas en una población. Incubación de PI Preparar, en medio de cultivo, una dilución fresca 1:10 de pi stock. Para el ensayo de absorción de PI, retire la placa de la incubadora y levante cuidadosamente el inserto. Añadir 13 μL de PI al medio, con una pipeta P20, obteniendo una concentración final de 2 μM.  Agte lentamente la placa antes de volver a colocar el inserto en su lugar. Asegúrese de que no haya burbujas debajo de las rebanadas. Vuelva a colocar las rodajas en la incubadora de 37 °C durante 2 h. Continúe con el protocolo de inmunohistoquímica, como se describe en la siguiente sección. Cubra las placas con aluminio, ya que PI es sensible a la luz. 4. Inmunohistoquímica NOTA: En inmunohistoquímica se utilizó un anticuerpo específico de la neurona, así como anticuerpos capaces de discriminar fenotipos de reposo y reactivos de la microglía y los astrocitos, para evaluar la extensión de la muerte neuronal y la gliosis en la corteza rinal-hipocampo epiléptico-como rebanadas organotípicas. Fijación tisular Retire la placa de la incubadora y aspire el medio. Fije las rebanadas con paraformadehído al 4% (PFA) durante 1 h en RT, añadiendo 1 mL de PFA debajo y por encima de las rodajas, con una pipeta P1000. Quite el PFA y agregue 1 mL de PBS. También agregue PBS debajo y por encima de las rebanadas. Mantenga las rodajas a 4 °C, en PBS, hasta su posterior uso. Siempre ponga parafilm alrededor de las placas para evitar el secado. Pasos de inmunotenstenimiento Lavar dos veces, 10 min cada vez, con 1 mL de PBS. Preparar una solución de permeabilización/bloqueo que contenga 1% de Tritón-X100, 10% de SA y 10% de BSA en PBS. Prepare la solución 5% BSA. Dibuja dos rectángulos con la pluma hidrofóbica (Figura 2A). Corte las rebanadas del inserto (Figura 2B) con una hoja muy afilada. Ponga dos rebanadas por diapositiva (Figura 2C) y agregue 140 μL de solución de permeabilización/bloqueo en la parte superior de cada rebanada, utilizando una pipeta P200. Incubar durante 3 h en RT. Diluir los anticuerpos primarios a la dilución de trabajo en BSA al 5% en PBS. Incubar con los anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C. Incubar con los anticuerpos secundarios durante 4 h a rt. A partir de este paso, proteja la placa de la luz ya que se está trabajando con fluoróforos. Colocar una gota de 50 μL de solución de Hoechst en la parte superior de cada rebanada e incubar durante 20 min a rt. Lavar entre incubaciones. Siempre lave tres veces, durante 10 minutos cada vez, con PBS-T. Retire Hoechst y lave como se recomienda. Añadir 50 μL de medio de montaje en la parte superior de cada rebanada. Cubrir con una cubierta de vidrio y rodear con esmalte de uñas (Figura 2D). Dejar secar a RT durante 24 h. Visualice el immunostaining bajo un microscopio confocal. Mantenga las rodajas manchadas a -20 °C. Figura 2: Procedimiento específico para el ensayo inmunohistoquístico. (A) Con la pluma hidrofóbica dibujar dos cuadrados en el tobogán. (B) Cortar el trozo de inserto que contiene la rebanada. (C) Coloque cada rebanada en los cuadrados dibujados con la pluma hidrofóbica e inicie el paso de permeabilización / bloqueo. (D) Después de concluir el protocolo, terminar montando las rebanadas en medio de montaje, cubriendo con una cubierta de vidrio y rodeándolo con esmalte de uñas. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.