Ein Modell der Epileptogenese in rhinalen Kortex-Hippocampus Organotypischen Schnittkulturen

Das portugiesische Gesetz und die Richtlinien der Europäischen Union (2010/63/EU) wurden bei allen Verfahren zum Schutz von Tieren für wissenschaftliche Zwecke eingehalten. Alle hier beschriebenen Methoden wurden von der Institutional Animal Welfare Body (ORBEA-iMM) des iMM und der zuständigen nationalen Behörde (DGAV – Direção Geral de Alimentação e Veterinária) genehmigt. 1. Herstellung von rhinalen Kortex-Hippocampus-Scheiben HINWEIS: Bei der Herstellung von rhinalen Kortex-Hippocampus-Scheiben werden P6-7 Sprague-Dawley-Ratten verwendet. Kulturaufbau und Medienvorbereitung Bereiten Sie am Tag vor der Kultur die erforderlichen Medien vor und legen Sie sie bei 4 °C ab. Präpariermedium: 25 mM Glukose in Gey’s Balanced Salt Solution (GBSS). Aufbereitungsmedium: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% Pferdeserum (HS), 25 mM Glukose, 30 μg/ml Gentamycin. Erhaltungsmedium vorbereiten: Neurobasal-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-Glutamin, 30 μg/ml Gentamycin, HS (15%, 10%, 5% und 0%). Gehirn-Ernte Kurz vor Beginn der Kultur 1,1 ml Kulturmedium in jede Vertiefung der 6-Well-Platte mit einer P1000-Pipette geben und bei 37 °C platzieren. Legen Sie alle Geräte (Seziermikroskop, Tissue Chopper, Sezierlampe, Sezierwerkzeuge, Elektroden, Platten, Einsätze und Filterpapiere) in die biologische Sicherheitswerkbank und sterilisieren Sie sie 15 Minuten lang unter UV-Licht. Passen Sie die Scheibendicke auf 350 μm an. Ziehen Sie das GBSS aus dem Kühlschrank. Fügen Sie 5 ml GBSS zu sechs Petrischalen hinzu. Pro Tier werden sechs Petrischalen benötigt. Euthanasieren Sie den Rattenwelp. Führen Sie die Enthauptung durch, indem Sie eine scharfe Schere an der Basis des Hirnstamms des Tieres verwenden. Waschen Sie den Tierkopf dreimal in kaltem GBSS und nehmen Sie ihn in die Sicherheitswerkbank. Gewebeisolierung und Aufbereitung von Scheiben Setzen Sie eine scharfe Zette fest in die Augenhöhlen ein, um den Kopf zu halten. Schneiden Sie mit einer dünnen Schere die Haut / Kopfhaut entlang der Mittellinie, beginnend mit dem Wirbelforamen in Richtung der Frontallappen und legen Sie sie beiseite. Schneiden Sie auf die gleiche Weise den Schädel und entlang der zerebralen Querfissur (Raum zwischen Gehirn und Kleinhirn). Mit einer gekrümmten langen Zette bewegen Sie sie auseinander. Entsorgen Sie die Riechkolben mit einem Spatel. Entfernen Sie das Gehirn vom Kopf und legen Sie es in eiskaltes GBSS mit der dorsalen Oberfläche nach oben (Abbildung 1A). Setzen Sie die feine Zette in das Kleinhirn ein und gehen Sie entlang der Mittellinie, wobei der Spatel jede Hemisphäre sehr vorsichtig öffnet (Abbildung 1B). Entfernen Sie mit einer kurzen Kurvenzette vorsichtig das überschüssige Gewebe, das die Hippocampi bedeckt, ohne die Hippocampusstruktur zu berühren. Dann mit einem Spatel unter jedem Hippocampus geschnitten (Abbildung 1C). Nehmen Sie eine Hemisphäre auf und legen Sie sie mit dem Hippocampus nach oben auf ein Filterpapier. Wiederholen Sie den Vorgang mit der anderen Hemisphäre und legen Sie sie parallel zur ersten in das Filterpapier. Legen Sie das Filterpapier auf den Tissue Chopper, wobei die Hemisphären senkrecht zur Klinge stehen, und schneiden Sie die Hemisphären in 350 μm Scheiben (Abbildung 1D). Legen Sie das geschnittene Gewebe in eine Petrischale mit kaltem GBSS (Abbildung 1E). Trennen Sie die Scheiben vorsichtig mit den Rundspitzenelektroden (Abbildung 1F). Bewahren Sie nur die Scheiben mit einem strukturell intakten Rhinalkortex und Hippocampus auf. DG- und CA-Bereiche sollten perfekt definiert sein, ebenso wie der entorhinale und perirhinale Kortex (Abbildung 1G). Legen Sie jede Scheibe mit einem Spatel und einer runden Spitzenelektrode auf den Einsatz (Abbildung 1H-I). Entfernen Sie überschüssiges Dissektionsmedium um jede Scheibe mit einer P20-Pipette (Abbildung 1J). Vier rhinale Kortex-Hippocampus-Scheiben können in einem einzigen Einsatz kultiviert werden (Abbildung 1K). Kulturpflege Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag. Erwärmen Sie das Medium bei 37 °C. Nehmen Sie die Platten aus dem Inkubator. Nehmen Sie jeden Einsatz auf, indem Sie die Kunststoffkante mit einer Zette halten (Abbildung 1L). Verwenden Sie eine freie Hand, um das Medium aus dem Brunnen abzusaugen. Setzen Sie den Einsatz wieder in den Brunnen und fügen Sie mit einer P1000-Pipette 1 ml frisch erwärmtes Medium hinzu (Abbildung 1M). Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Einfügungen. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen zwischen der Membran und dem Medium eingeschlossen sind. HINWEIS: Epileptische Scheiben unterliegen einem allmählichen und kontrollierten Serumentzug im Medium. Ab 9 Tagen In Vitro (DIV) werden Slices in NBA ohne HS14gepflegt. Abbildung 1: Detailliertes Verfahren zur Herstellung von rhinalen Kortex-Hippocampus-organotypischen Scheiben. (A) Entfernen Sie das Gehirn vom Kopf und legen Sie es in eiskaltes GBSS mit der dorsalen Oberfläche nach oben. (B) Setzen Sie die Zette in das Kleinhirn ein. Öffnen Sie das Gehirn durch die Mittellinie und entfernen Sie das überschüssige Gewebe über dem Hippocampus. (C) Mit einem Spatel, der unterhalb des Hippocampus geschnitten ist, wie durch die Pfeile angezeigt. (D) Legen Sie beide Hippocampi nach oben und parallel zueinander auf das Filterpapier und schneiden Sie 350 μm Scheiben auf den Tissue Chopper. (E) Legen Sie den in Scheiben geschnittenen Hippocampus in eiskalte GBSS. (F) Trennen Sie die Scheiben mit Hilfe von runden Glaselektroden. (G) Wählen Sie nur die Scheiben, die einen intakten rhinalen Kortex und Hippocampus darstellen. (H, I) Mit Hilfe einer runden Glaselektrode jede Scheibe auf den Spatel drücken und auf den Einsatz legen. (J) Entfernen Sie die GBSS, die das Slice umgibt. (K) Legen Sie vier Scheiben pro Einlage. (L) Um das Medium zu wechseln, heben Sie den Einsatz an und saugen Sie das Medium mit einer Glaspipette an. (M) Fügen Sie frisches Medium hinzu, indem Sie die Pipette zwischen den Einsatz und die Wände der 6-Wells-Platte legen. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen unter den Scheiben befinden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 2. Elektrophysiologische Aufnahmen HINWEIS: Elektrophysiologische Aufnahmen wurden in rhinalen kortex-hippocampus organotypischen Scheiben an 7, 14 und 21 DIV in einer Grenzflächenkammer durchgeführt. Aufnahmen wurden mit einem Verstärker aufgenommen, digitalisiert und mit Software analysiert. Alle Aufnahmen waren bandpassgefiltert (achtpoliger Besselfilter bei 60 Hz und Gaußscher Filter bei 600 Hz). Setup-Vorbereitung Bereiten Sie 50 ml NBA-Medium mit 1 ml B27 und 250 μL L-Glutamin vor. Aufwärmen bei 37 °C. Stellen Sie das Elektrophysiologie-Setup in einen engen Kreislauf. Überprüfen Sie, ob die Durchflussrate 2 ml/min beträgt. Öffnen Sie das Carbox-Ventil(5%CO 2 /95% O2)und überprüfen Sie den Wasserstand im System. Legen Sie das Filterpapier in die Aufzeichnungskammer der Schnittstelle, um überschüssiges Medium abzulassen, und das Linsenreinigungspapier unter den Rahmen, um die Scheibe mit Medium zu versorgen. Schalten Sie den Temperaturregler, die Verstärker und den Mikromanipulator ein. Lassen Sie die Temperatur in der Grenzflächenkammer bei 37 °C stabilisieren, bevor Sie mit den Aufnahmen beginnen. Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF: 124 mM NaCl, 3mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4,25 mM NaHCO3,10 mM Glucose, 2 mM CaCl2,1 mM MgSO4 mit pH 7,4) vorbereiten und damit die Glaselektrode mit einer Spritze füllen. Legen Sie es in die Empfangselektrode. Aufzeichnungen spontaner Aktivitäten Sobald die Temperatur stabil ist, entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und schneiden Sie eine Scheibe aus dem Einsatz mit einer hochscharfen Klinge. Legen Sie es in eine 60-mm-Platte mit einem Tropfen Medium. Bringen Sie es zur Aufnahmekammer der Schnittstelle. Legen Sie die Scheibe in die Grenzflächenkammer mit dem Hippocampus unten rechts. Platzieren Sie die Empfangselektrode in der CA3-Pyramidenzellschicht. Fahren Sie mit dem kontinuierlichen Erfassungsprotokoll fort und zeichnen Sie 30 Minuten lang auf. 3. PI-Aufnahmetest HINWEIS: Der Zelltod wurde durch Überwachung der zellulären Aufnahme des Fluoreszenzfarbstoffs Propidiiumiodid (PI) beurteilt. PI ist eine polare Verbindung, die in Zellen mit beschädigten Zellmembranen eindringt und mit DNA interagiert, die rote Fluoreszenz emittiert (Absorption 493 nm, Emission 630 nm). Da PI für lebende Zellen nicht durchdrungen ist, wird es verwendet, um tote Zellen in einer Population zu erkennen. PI-Inkubation Bereiten Sie in Kulturmedium eine frische 1:10-Verdünnung des PI-Bestands vor. Für den PI-Aufnahmetest entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und heben Sie den Einsatz vorsichtig an. 13 μL PI werden mit einer P20-Pipette in das Medium geben, wodurch eine Endkonzentration von 2 μM erreicht wird.  Rühren Sie die Platte langsam auf, bevor Sie den Einsatz wieder einsetzen. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen unter den Scheiben befinden. Legen Sie die Scheiben für 2 h wieder in den 37 °C Inkubator. Fahren Sie mit dem immunhistochemischen Protokoll fort, wie im nächsten Abschnitt beschrieben. Decken Sie die Platten mit Aluminium ab, da PI lichtempfindlich ist. 4. Immunhistochemie HINWEIS: In der Immunhistochemie wurden ein neuronenspezifischer Antikörper sowie Antikörper, die ruhende und reaktive Phänotypen von Mikroglia und Astrozyten unterscheiden können, verwendet, um das Ausdehnen des neuronalen Todes und der Gliose in rhinalen Kortex-Hippocampus-epileptischen organotypischen Scheiben zu bewerten. Gewebefixierung Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und saugen Sie das Medium an. Fixieren Sie die Scheiben mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 1 h bei RT, indem Sie 1 ml PFA unter und über den Scheiben mit einer P1000-Pipette hinzufügen. Entfernen Sie die PFA und fügen Sie 1 ml PBS hinzu. Fügen Sie auch PBS unter und über den Slices hinzu. Bewahren Sie die Scheiben bei 4 °C in PBS auf, bis sie weiter verwendet werden. Legen Sie immer Parafilm um die Platten, um ein Austrocknen zu vermeiden. Immunanfingende Schritte Zweimal waschen, jeweils 10 min, mit 1 ml PBS. Permeabilisierungs-/Blockierungslösung mit 1% Triton-X100, 10% HS und 10% BSA in PBS vorbereiten. Bereiten Sie 5% BSA-Lösung vor. Zeichnen Sie zwei Rechtecke mit dem hydrophoben Stift (Abbildung 2A). Schneiden Sie die Scheiben aus dem Einsatz (Abbildung 2B) mit einer hochscharfen Klinge. Legen Sie zwei Scheiben pro Objektträger (Abbildung 2C) und fügen Sie 140 μL Permeabilisierungs-/Blockierungslösung mit einer P200-Pipette auf die Oberseite jeder Scheibe hinzu. Inkubieren Sie für 3 h bei RT. Verdünnen Sie die primären Antikörper gegen die Arbeitsverdünnung in 5% BSA in PBS. Mit den primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C inkubieren. Inkubieren Sie mit den sekundären Antikörpern für 4 h bei RT. Schützen Sie die Platte ab diesem Schritt vor Licht, da mit Fluorophoren gearbeitet wird. Legen Sie einen 50 μL Tropfen Hoechst-Lösung auf die Oberseite jeder Scheibe und inkubieren Sie sie für 20 Minuten bei RT. Zwischen den Inkubationen waschen. Immer dreimal waschen, jedes Mal für 10 min, mit PBS-T. Hoechst entfernen und wie empfohlen waschen. Fügen Sie 50 μL Montagemedium auf die Oberseite jeder Scheibe hinzu. Mit einem Glasdeckel abdecken und mit Nagellack umgeben (Abbildung 2D). Lassen Sie es bei RT für 24 h trocknen. Visualisieren Sie die Immunfärbung unter einem konfokalen Mikroskop. Die gebeizten Scheiben bei -20 °C aufbewahren. Abbildung 2: Spezifisches Verfahren für den immunhistochemischen Assay. (A) Mit dem hydrophoben Stift zwei Quadrate in den Schieber zeichnen. (B) Schneiden Sie das Stück der Einlage, das die Scheibe enthält. (C) Legen Sie jede Scheibe in die mit dem hydrophoben Stift gezeichneten Quadrate und starten Sie den Permeabilisierungs-/Blockierungsschritt. (D) Nach Abschluss des Protokolls werden die Scheiben in einem Montagemedium montiert, mit einem Glasdeckel bedeckt und mit Nagellack umschlossen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.