リナル皮質-海馬の組織性スライス培養におけるてんかん発生のモデル

ポルトガルの法律と欧州連合(EU)のガイドライン(2010/63/EU)は、科学的目的のための動物の保護に関するすべての手続きで尊重されました。ここに記載されているすべての方法は、iMMの制度的動物福祉機関(ORBEA-iMM)と国家権限(DGAV – ディレソン・デ・アリメンタサン・エ・ヴェテリナリア)によって承認されました。 1. 鼻皮質海馬スライスの調製 注:鼻皮質海馬スライスの調製は、P6-7スプレイグドーリーラットを使用しています。 培養のセットアップと培地の準備 培養前日に、必要な培地を用意し、4°Cにします。 解剖培地を準備する:25 mMのグルコースをゲイのバランス塩溶液(GBSS)に入れます。 培養培地を調製する:50%オプティ-MEM、25%HBSS、25%ホースセラム(HS)、25 mMグルコース、30 μg/mLゲンタマイシン。 メンテナンス培地を準備する:ニューロバサル-A(NBA)、27、1 mM L-グルタミン、30 μg/mLゲンタマイシン、HS(15%、10%、5%および0%)。 脳の収穫 培養を始める直前に、P1000ピペットを用いて6ウェルプレートのウェルに1.1mLの培養液を加え、37°Cに置きます。 すべての機器(解剖顕微鏡、ティッシュチョッパー、解剖ランプ、解剖ツール、電極、プレート、インサート、フィルターペーパー)を生物学的安全キャビネットの中に入れ、UV光下で15分間殺菌します。 スライスの厚さを350μmに調整します。 冷蔵庫から GBSS を引き出します。6つのペトリ皿に5mLのGBSSを加えます。動物1匹につきペトリ料理が6個必要です。 ネズミの子犬を安楽死させる。動物の脳幹の基部に鋭利なはさみを使用して切断を行う。 動物の頭部を冷たいGBSSで3回洗い、安全キャビネットの中に持ち込みます。 組織の分離とスライスの準備 鋭い鉗子を眼窩にしっかりと挿入して頭を保持します。 薄いはさみを使用して、脊椎の前部から前頭葉に向かって始まる正中線に沿って皮膚/頭皮をカットし、脇に置きます。 頭蓋骨と脳横裂き(脳と小脳の間の空間)に沿って同じ方法でカットします。湾曲した長い鉗子で、それを離して動かします。 へらで嗅球を捨てます。頭から脳を取り除き、後頭部を上に向けた氷冷GBSSに入れる(図1A)。 細かい鉗子を小脳に挿入し、ヘラが各半球を非常に慎重に開いて中線に沿って行く(図1B)。 短い曲線鉗子では、海馬の構造に触れることなく、海馬を覆う余分な組織を慎重に取り除く。次に、スパチュラで、各海馬の下に切り取ります(図1C)。 1つの半球を拾い上げ、海馬を上に向けてろ紙の上に置きます。もう一方の半球で手順を繰り返し、最初の半球と平行にフィルタペーパーに配置します。フィルターペーパーをティッシュチョッパーの上に置き、半球を刃に垂直にして、半球を350μmのスライスで切った(図1D)。 スライスしたティッシュを冷たいGBSSのペトリ皿に入れる(図1E)。 丸い先端電極を使用してスライスを慎重に分離します(図1F)。構造的に無傷の鼻皮質と海馬を持つスライスのみを保管してください。DGとCA領域は、完全に定義されるべきであり、また、内膜および内膜皮質(図1G)である。 各スライスを挿入物(図1H-I)に、ヘラと丸い先端電極を付けて置きます。P20ピペットを使用して各スライスの周囲に余分な解剖媒体を取り除く(図1J)。4つの鼻皮質海馬スライスは、単一のインサートで培養することができる(図1K)。 文化のメンテナンス 1 日おきにメディアを変更します。 37°Cで温めます。 インキュベーターからプレートを取ります。プラスチック製のエッジを鉗子で保持して、各インサートを拾います(図1L)。 フリーハンドを使用して、ウェルから培地を吸引します。インサートをウェルに戻し、P1000ピペットを加えた新鮮な温めた媒体を1mL加えます(図1M)。すべての挿入に対して繰り返します。膜と媒体の間に気泡が閉じ込められないようにしてください。 注:てんかん様スライスは、培地中の血清の徐々に制御された剥奪を受ける。9日間インビトロ(DIV)から、スライスはHS14なしでNBAで維持されています。 図1:鼻皮質海馬組織のスライスの調製のための詳細な手順。(A) 頭から脳を取り出し、後ろ面を上にして氷冷GBSSに入れる。(B)鉗子を小脳に挿入する。正中線を通して脳を開き、海馬の上に余分な組織を取り除きます.(C) 矢印で示されるように、海馬の下にヘラを切り取った。(D)両方の海馬を上下に向けて両面に置き、フィルターペーパーにかけ、ティッシュチョッパーの上に350μmのスライスを切る。(E) スライスした海馬を氷冷GBSSに入れる。(F)丸いガラス電極の助けを借りてスライスを分離します。(G)無傷の鼻皮質と海馬を描写するスライスのみを選択します。(H, I)丸い先端ガラス電極の助けを借りて、各スライスをスパチュラに押し込み、挿入物の上に置きます。(J) スライスを囲む GBSS を削除します。(K) 挿入ごとに 4 つのスライスを配置します。(L)培地を交換するには、挿入物を持ち上げて、ガラスピペットで培地を吸引する。(M)6ウェルプレートのインサートと壁の間にピペットを配置して、新鮮な培地を追加します。スライスの下に気泡がないことを確認します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 2. 電気生理学的記録 注:電気生理学的記録は、界面型チャンバーの7、14、21 DIVの鼻皮海馬組織性スライスで行われました。録音は、ソフトウェアでデジタル化し、分析、アンプで取得しました。すべての録音はバンドパスをフィルタリングしました(60 Hzの8極のベッセルフィルタと600Hzのガウスフィルタ)。 セットアップの準備 1 mLのB27と250 μLのL-グルタミンで、NBA培地50 mLを調製します。37°Cでウォームアップします。 電気生理学の設定を閉回路に設定します。流量が2 mL/minであるかどうかを確認します。 カーボックス(5%CO2/95%O2)バルブを開き、システム内の水位を確認します。 過剰な媒体を排出するために、過剰な媒体とレンズクリーニングペーパーをフレームの下に排出するために、フィルタペーパーをインターフェイス記録チャンバーに入れて、スライスに媒体を供給します。 温度コントローラ、アンプ、マイクロマニピュレータをオンにします。 録音を開始する前に、インターフェイスチャンバ内の温度を37 °Cで安定させてください。 人工脳脊髄液(aCSF:124 mM NaCl、3mM KCl、1.2 mM NaH2PO4、25mM NaHCO3、10mMグルコース、2 mM CaCl2、1mM MgSO4 にpH 7.4)を用意し、ガラス電極にスポリンジを充填するために使用します。受取電極に入れる。 自発的活動の記録 温度が安定したら、インキュベーターからプレートを取り出し、非常に鋭い刃で挿入物から1つのスライスを切ります。60mmのプレートに、中滴を入れなさい。インターフェイス記録室にそれを取る。 右側に海馬とインターフェイスチャンバーにスライスを配置します。受取電極をCA3ピラミッド型セル層に配置します。 連続取得プロトコルに進み、30分間の記録を記録します。 3. PI取り込みアッセイ 注:細胞死は、蛍光色素ヨウ化プロピジウム(PI)の細胞取り込み量をモニタリングすることによって評価した。PIは、細胞膜を損傷した細胞に入り込み、赤色蛍光を発するDNA(吸光度493nm、発光630nm)と相互作用する極性化合物です。PIは生きた細胞に対しては意味をなさないので、集団中の死んだ細胞を検出するために使用される。 PI インキュベーション 培養培地で、PIストックの新鮮な1:10希釈液を調製する。 PI取り込みアッセイの場合は、インキュベーターからプレートを取り外し、慎重に挿入物を上げます。13 μL の PI を培地に加え、P20 ピペットを使用して、2 μM の最終濃度を得る。 インサートを所定の位置に戻す前に、ゆっくりとプレートを攪拌します。スライスの下に泡がないことを確認します。 スライスを37°Cインキュベーターに2時間戻します。 次のセクションで説明するように、免疫検査プロトコルを進めます。PIは光に敏感なので、プレートをアルミニウムで覆います。 4. 免疫染色化学 注:免疫組織化学では、ニューロン特異的抗体、ならびにミクログリアおよび星状細胞の休息および反応性表現型を識別できる抗体と同様に、神経細胞- 海馬てんかん様のorganotypicsliceにおける神経死および神経膠痛の拡張を評価するために使用された。 組織固定 プレートをインキュベーターから取り出し、培地を吸引します。P1000ピペットで、1 mLのPFAをスライスの下と上に加えて、RTで1時間、4%パラホルムアルデヒド(PFA)でスライスを固定します。 PFAを取り出し、PBSを1 mL追加します。また、スライスの下と上にPBSを追加します。 スライスは、さらに使用するまで、PBSで4°Cに保ちます。乾燥を避けるために、常にパラフィルムをプレートの周りに置きます。 免疫染色工程 2回、10分ずつ、PBSを1mLで洗います。 PBSで1%トリトンX100、10%HSおよび10%BSAを含むパーメアビライズ/ブロッキング溶液を調製します。5%BSA溶液を準備します。 疎水性ペンで2つの長方形を描きます(図2A)。鋭い刃で、挿入物(図2B)からスライスを切ります。スライドごとに2つのスライス(図2C)を入れ、P200ピペットを使用して各スライスの上部に140 μLのパーメアビライゼーション/ブロッキング溶液を追加します。RTで3時間インキュベートします。 PBSで5%BSAで働く希釈に一次抗体を希釈します。一次抗体を4°Cで一晩インキュベートする。 RTで4時間二次抗体とインキュベートする。このステップから、蛍光灯が取り扱われているので、プレートを光から守ります。 各スライスの上に50μLのHoechst溶液を置き、RTで20分間インキュベートします。 インキュベーションの間で洗います。必ず3回、毎回10分間、PBS-Tで洗ってください。 Hoechstを取り出し、推奨どおりに洗います。 各スライスの上部に50μLの取り付け媒体を追加します。ガラスカバースリップで覆い、マニキュアで囲みます(図2D)。 RTで24時間乾燥させます。 共焦点顕微鏡下で免疫染色を可視化します。染色したスライスを-20°Cに保ちます。 図2:免疫検査の測定法に関する具体的な手順(A)疎水性ペンでスライドに2つの正方形を描きます。(B) スライスを含む挿入部分を切り取ります。(C)疎水性ペンで描かれた正方形に各スライスを配置し、パーメアビゼーション/ブロッキングステップを開始します。(D)プロトコルを締結した後、スライスを取り付け媒体に取り付け、ガラスカバースリップで覆い、マニキュアで囲んで仕上げます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。