Um Modelo de Epipetogênese em Culturas de Fatia Organotipica Do Cortex-Hipocampo Rhinal

As diretrizes da legislação portuguesa e da União Europeia (2010/63/UE) foram respeitadas em todos os procedimentos relativos à proteção dos animais para fins científicos. Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Órgão Institucional de Bem-Estar Animal (ORBEA-iMM) do IMM e pela Autoridade Nacional competente (DGAV – Direção Geral de Alimentação e Veterinária). 1. Preparação de fatias de córtex-hipocampo rhinal NOTA: A preparação de fatias de córtex-hipocampo rhinal usa ratos P6-7 Sprague-Dawley. Configuração cultural e preparação média Na véspera da cultura, prepare os meios de comunicação necessários e coloque-os a 4 °C. Prepare o meio de dissecção: 25 mM de glicose na Solução de Sal Balanceado da Gey (GBSS). Preparar meio de cultura: 50% Opti-MEM, 25% HBSS, 25% Soro de Cavalo (HS), 25 mM de glicose, 30 μg/mL Gentamicina. Preparar o meio de manutenção: Neurobasal-A (NBA), 2% B27, 1 mM L-glutamina, 30 μg/mL Gentamicina, HS (15%, 10%, 5% e 0%). Colheita cerebral Pouco antes de iniciar a cultura, adicione 1,1 mL de cultura média a cada poço da placa de 6 poços com uma pipeta P1000 e coloque-a a 37 °C. Coloque todos os equipamentos (microscópio de dissecção, helicóptero de tecido, lâmpada dissecando, ferramentas de dissecação, eletrodos, placas, inserções e papéis de filtro) dentro do armário de segurança biológica e esterilize sob luz UV por 15 minutos. Ajuste a espessura da fatia para 350 μm. Retire o GBSS da geladeira. Adicione 5 mL de GBSS a seis pratos de Petri. Serão exigidas seis pratos de Petri por animal. Eutanize o filhote de rato. Faça a decapitação usando uma tesoura afiada na base do tronco cerebral do animal. Lave a cabeça do animal três vezes em GBSS frio e leve-a para dentro do armário de segurança. Isolamento tecidual e preparação de fatias Insira firmemente fórceps afiados nas órbitas oculares para segurar a cabeça. Usando uma tesoura fina corte a pele/couro cabeludo ao longo da linha média começando do foien vertebral em direção aos lobos frontais e colocá-lo de lado. Corte da mesma forma o crânio e ao longo da fissura transversal cerebral (espaço entre cérebro e cerebelo). Com fórceps longos curvados, afaste-o. Descarte as lâmpadas olfativas com uma espátula. Remova o cérebro da cabeça e coloque-o em GBSS gelado com a superfície dorsal enfrentada(Figura 1A). Insira as fórceps finas no cerebelo e siga a linha média com a espátula abrindo cada hemisfério com muito cuidado(Figura 1B). Com fórceps curvas curtas, remova cuidadosamente o excesso de tecido que cobre o hipocampi, sem tocar na estrutura hipocampal. Em seguida, com uma espátula, corte abaixo de cada hipocampo (Figura 1C). Pegue um hemisfério e coloque-o, com hipocampo virado para cima, em um papel filtro. Repita o procedimento com o outro hemisfério e coloque-o paralelamente ao primeiro, no papel filtro. Coloque o papel filtro no helicóptero de tecido, com os hemisférios perpendiculares à lâmina, e corte os hemisférios em fatias de 350 μm(Figura 1D). Coloque o tecido fatiado em uma placa de Petri com GBSS frio(Figura 1E). Separe cuidadosamente as fatias usando os eletrodos de ponta redonda(Figura 1F). Mantenha apenas as fatias com um córtex rhinal estruturalmente intacto e hipocampo. As áreas de DG e CA devem ser perfeitamente definidas, assim como o córtex entorhinal e perirhinal(Figura 1G). Coloque cada fatia na pastilha(Figura 1H-I),com uma espátula e um eletrodo de ponta redonda. Remova o meio de dissecção em excesso em cada fatia com uma pipeta P20(Figura 1J). Quatro fatias de córtex-hipocampo rhinal podem ser cultivadas em uma única inserção(Figura 1K). Manutenção da cultura Mude o meio dia não. Aqueça o meio a 37 °C. Pegue as placas da incubadora. Pegue cada inserção segurando a borda plástica com fórceps(Figura 1L). Use uma mão livre para aspirar o meio do poço. Coloque a inserção de volta no poço e adicione 1 mL, com uma pipeta P1000, de meio fresco aquecido(Figura 1M). Repita para todas as pastilhas. Certifique-se de que nenhuma bolha de ar está presa entre a membrana e o meio. NOTA: As fatias epilépticas sofrem uma privação gradual e controlada do soro no meio. A partir de 9 Dias In Vitro (DIV) em diante, as fatias são mantidas na NBA sem HS14. Figura 1: Procedimento detalhado para a preparação de fatias organotipópicas do córtex-hipocampo rhinal. (A) Remova o cérebro da cabeça e coloque-o em GBSS gelado com a superfície dorsal enfrentada. (B) Insira as fórceps no cerebelo. Abra o cérebro através da linha média e remova o excesso de tecido sobre o hipocampo. (C) Com uma espátula cortada abaixo do hipocampo, conforme indicado pelas setas. (D) Coloque os dois hipocampi voltados para cima e paralelos entre si no papel do filtro e corte fatias de 350 μm no helicóptero de tecido. (E) Coloque o hipocampo fatiado em GBSS gelado. (F) Separe as fatias com a ajuda de eletrodos de vidro com ponta redonda. (G) Escolha apenas as fatias que retratam um córtex rhinal intacto e hipocampo. (H, eu) Com a ajuda de um eletrodo de vidro redondo, empurre cada fatia para a espátula e coloque-a na pastilha. (J) Remova o GBSS ao redor da fatia. (K) Coloque quatro fatias por inserção. (L) Para trocar o meio, levante a pastilha e aspire o meio com uma pipeta de vidro. (M) Adicione o meio fresco colocando a pipeta entre a pastilha e as paredes da placa de 6 poços. Certifique-se de que não há bolhas de ar sob as fatias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 2. Gravações eletrofisiológicas NOTA: As gravações eletrofisiológicas foram realizadas em fatias organotipópicas do córtex rhinal-hipocampo aos 7, 14 e 21 DIV em uma câmara tipo interface. As gravações foram obtidas com um amplificador, digitalizado e analisado com software. Todas as gravações foram filtradas por band-pass (filtro Bessel de oito polos a 60 Hz e filtro gaussiano a 600 Hz). Preparação de configuração Prepare 50 mL de média nba com 1 mL de B27 e 250 μL de L-Glutamina. Aqueça a 37 °C. Coloque a configuração de eletrofisiologia em circuito próximo. Verifique se a vazão é de 2 mL/min. Abra a caixa de carro (válvula de 5% DE CO2/95% O2) e verifique o nível de água no sistema. Coloque o papel do filtro na câmara de gravação da interface para drenar o excesso médio e o papel de limpeza da lente sob o quadro para fornecer meio à fatia. Ligue o controlador de temperatura, os amplificadores e o micromanipulador. Deixe a temperatura na câmara de interface estabilizar a 37 °C antes de iniciar as gravações. Prepare o fluido cerebrospinal artificial (aCSF: 124 mM NaCl, 3mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4, 25 mM NaHCO3, 10 mM de glicose, 2 mM CaCl2, 1 mM MgSO4 com pH 7.4) e use-o para encher o eletrodo de vidro com um seringe. Coloque-o no eletrodo receptor. Gravações de atividade espontânea Uma vez que a temperatura esteja estável, retire a placa da incubadora e corte uma fatia da pastilha com uma lâmina altamente afiada. Coloque-o em uma placa de 60 mm com uma gota de meio. Leve-o para a câmara de gravação de interface. Coloque a fatia na câmara de interface com o hipocampo para a direita inferior. Coloque o eletrodo receptor na camada de célula piramimácida CA3. Prossiga para o protocolo de aquisição contínua e regisário por 30 min. 3. Ensaio de absorção de PI NOTA: A morte celular foi avaliada pelo monitoramento da captação celular do iodeto de ílio de corante fluorescente (PI). Pi é um composto polar, que entra em células com membranas celulares danificadas e interage com o DNA emitindo fluorescência vermelha (absorvância de 493 nm, emissão de 630 nm). Como o PI não é permeante para células vivas, é usado para detectar células mortas em uma população. Incubação pi Prepare, em meio de cultura, uma diluição fresca de 1:10 do estoque de PI. Para o ensaio de absorção de PI, retire a placa da incubadora e levante cuidadosamente a pastilha. Adicione 13 μL de PI ao meio, com uma pipeta P20, obtendo uma concentração final de 2 μM.  Agitar lentamente a placa antes de colocar a inserção de volta no lugar. Certifique-se de que não há bolhas sob as fatias. Coloque as fatias de volta na incubadora de 37 °C por 2h. Prossiga com o protocolo de imunohistoquímica, conforme descrito na próxima seção. Cubra as placas com alumínio, já que a PI é sensível à luz. 4. Imunohistoquímica NOTA: Na imunohistoquímica um anticorpo específico do neurônio, bem como anticorpos capazes de discriminar fenótipos de repouso e reativas de microglia e astrócitos, foram utilizados para avaliar a extensão da morte neuronal e gliose em fatias organotipos epilépticos do córtex rhinal. Fixação tecidual Retire a placa da incubadora e aspire o meio. Fixar as fatias com 4% de paraformaldeído (PFA) por 1h no RT, adicionando 1 mL de PFA abaixo e acima das fatias, com uma pipeta P1000. Remova o PFA e adicione 1 mL de PBS. Adicione também PBS por baixo e acima das fatias. Mantenha as fatias a 4 °C, em PBS, até que use mais. Coloque sempre o parafilm ao redor das placas para evitar a secagem. Passos de imunossuar Lave duas vezes, 10 min cada vez, com 1 mL de PBS. Prepare a solução de permeabilização/bloqueio contendo 1% Triton-X100, 10% HS e 10% BSA na PBS. Prepare a solução BSA de 5%. Desenhe dois retângulos com a caneta hidrofóbica(Figura 2A). Corte as fatias da pastilha(Figura 2B)com uma lâmina altamente afiada. Coloque duas fatias por slide (Figura 2C) e adicione 140 μL de solução de permeabilização/bloqueio na parte superior de cada fatia, usando uma pipeta P200. Incubar por 3 h na RT. Diluir os anticorpos primários à diluição de trabalho em 5% de BSA na PBS. Incubar com os anticorpos primários durante a noite a 4 °C. Incubar com os anticorpos secundários por 4h na RT. A partir deste passo, proteja a placa da luz, uma vez que os fluoroforos estão sendo trabalhados. Coloque uma gota de 50 μL da solução Hoechst na parte superior de cada fatia e incubar por 20 minutos na RT. Lave entre incubações. Lave sempre três vezes, por 10 minutos cada vez, com PBS-T. Remova Hoechst e lave conforme recomendado. Adicione 50 μL de meio de montagem na parte superior de cada fatia. Cubra com uma tampa de vidro e rodee com esmalte(Figura 2D). Deixe secar na RT por 24 h. Visualize a imunostaining sob um microscópio confocal. Mantenha as fatias manchadas a -20 °C. Figura 2: Procedimento específico para o ensaio imunohistoquímico. (A) Com a caneta hidrofóbica desenhe dois quadrados no escorregador. (B) Corte a peça de inserção que contém a fatia. (C) Coloque cada fatia nos quadrados desenhados com a caneta hidrofóbica e inicie a etapa de permeabilização/bloqueio. (D) Após concluir o protocolo, finalize montando as fatias em meio de montagem, cobrindo com um deslizamento de vidro e cercando-o com esmalte. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.