نموذج لتولد الصرع في رينال القشرة-قرن آمون ثقافات شريحة العضوية
Summary
هنا، ونحن نصف إعداد شرائح القشرة قرن آمون rhinal organotypic. في ظل الحرمان التدريجي والسيطرة عليها من المصل، وهذه الشرائح تصور الأحداث المتطورة مثل الصرع ويمكن اعتبار نموذج الجسم الحي السابق من تكوين الصرع. يمثل هذا النظام أداة ممتازة لرصد ديناميات النشاط التلقائي ، وكذلك لتقييم تطور الميزات العصبية خلال فترة تكوين الصرع.
Abstract
وقد استخدمت على نطاق واسع الثقافات شريحة Organotypic لنموذج اضطرابات الدماغ وتعتبر منصات ممتازة لتقييم الإمكانات العصبية والعلاجية للدواء. يتم إعداد شرائح Organotypic من الأنسجة المقشرة وتمثل بيئة الجسم الحي متعدد الخلايا المعقدة. أنها تحافظ على الخلايا ثلاثية الأبعاد والبيئة المحلية لخلايا الدماغ، والحفاظ على اتصال الخلايا العصبية والتفاعل المتبادل بين الخلايا العصبية وغليا. تعتبر شرائح فرس النهر العضوية مناسبة لاستكشاف الآليات الأساسية لتولد الصرع ، ولكن الأبحاث السريرية والنماذج الحيوانية للصرع تشير إلى أن القشرة الرهينية ، المكونة من القشريات البينة والبينة ، تلعب دورا مناسبا في توليد المضبوطات.
هنا، ونحن نصف إعداد شرائح القشرة قرن آمون rhinal organotypic. وأظهرت تسجيلات النشاط العفوي من منطقة CA3 تحت التشوه مع متوسط النمو الكامل ، في درجة الحرارة الفسيولوجية وفي غياب التلاعب الدوائي ، أن هذه الشرائح تصور الأحداث المتطورة الشبيهة بالصرع على مر الزمن في الثقافة. ولوحظ أيضا زيادة موت الخلايا، من خلال فحص امتصاص يوديد البروبيديوم، وداء الدبقي، الذي تم تقييمه بالكيمياء المناعية المقترنة بالفلور. النهج التجريبي المقدم يسلط الضوء على قيمة الثقافات شريحة القشرة قرن آمون rhinal organotypic كمنصة لدراسة ديناميات وتطور الصرع وفحص الأهداف العلاجية المحتملة لهذا علم أمراض الدماغ.
Introduction
يتميز الصرع، وهو واحد من أكثر الاضطرابات العصبية انتشارا في جميع أنحاء العالم، بالحدوث الدوري وغير المتوقع للنشاط العصبي المتزامن والمفرط في الدماغ. على الرغم من الأدوية المضادة للصرع المختلفة (AEDs) المتاحة ، فإن ثلث المرضى الذين يعانون من الصرع يعانون من الانكسار للعلاج1 ويستمرون في تجربة النوبات والتدهور المعرفي. وعلاوة على ذلك، الاعزانات AEDs المتاحة تعوق الإدراك بسبب أعمالهم المعممة نسبيا على نشاط الخلايا العصبية. من الصعب دراسة تكوين الصرع في البشر ، بسبب إصابات الصرع المتعددة وغير المتجانسة ، وفترات كامنة طويلة تستمر من أشهر إلى عقود ، والآثار المضللة للعلاج المضاد للاختلاج بعد النوبة التلقائية الأولى.
أصبح تحديد العوامل العلاجية المحتملة لعلاج الصرع ممكنا بسبب النماذج الحيوانية للصرع: 1) النماذج الوراثية ، التي تستخدم الحيوانات المهيأة وراثيا التي تحدث فيها النوبات تلقائيا أو استجابة لتحفيز حسي ؛ 1) النماذج الوراثية التي تستخدم الحيوانات المهيأة وراثيا والتي تحدث فيها النوبات تلقائيا أو استجابة لتحفيز حسي ؛ 1) النماذج الوراثية التي تستخدمها الحيوانات المهيأة وراثيا والتي تحدث فيها النوبات تلقائيا أو استجابة لتحفيز حسي؛ (2) النماذج الوراثية التي تستخدم العوامل الوراثية التي تحدث فيها التشنجات بشكل تلقائي أو استجابة لتحفيز حسي؛ (2) العوامل الوراثية المحتملة لعلاج الصرع؛ (2) النماذج الوراثية التي تستخدم الحيوانات الم 2) نماذج من المضبوطات الناجمة عن التحفيز الكهربائي؛ و 3) نماذج الدوائية من التعريفي المضبوطات التي تستخدم pilocarpine (ناهض مستقبلات موسكارينيك), كاينات (ناهض مستقبلات كاينات) أو 4-aminopyridine (مانع قناة البوتاسيوم), من بين أمور أخرى. وكانت هذه النماذج حاسمة في فهم التغيرات السلوكية، فضلا عن الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء الصرع، وأنها أدت إلى اكتشاف العديد من الأمراض غير المشعةبالكهرباء 2.
الاستعدادات الجسم الحي السابق هي أيضا أداة قوية لاستكشاف الآليات الكامنة وراء الصرع وeptogenesis. شرائح فرس النهر الحادة، والتي تمكن الدراسات الكهربية للخلايا الحية على مدى فترة 6-12 ساعة، وشرائح فرس النهر organotypic التي يمكن الحفاظ عليها في حاضنة على مدى أيام أو أسابيع وقد استخدمت على نطاق واسع في دراسات نشاط الصرع3.
يتم إعداد شرائح الدماغ Organotypic من الأنسجة المقشرة وتمثل نموذجا فسيولوجيا ثلاثي الأبعاد للدماغ. هذه الشرائح الحفاظ على الخلايا في المنطقة ذات الاهتمام وتشمل جميع خلايا المخ والاتصال بين الخلايا4. المنطقة الأكثر استخداما للثقافات العضوية على المدى الطويل هو قرن آمون، كما تتأثر هذه المنطقة من فقدان الخلايا العصبية في ظروف عصبية متعددة. وقد استخدمت على نطاق واسع لنموذج اضطرابات الدماغ وتعتبر أدوات ممتازة لتقييم الإمكانات العصبية والعلاجية للدواء5,6. ووصفت نماذج من الصرع والسكتة الدماغية والسمية الناجمة عن Aβ في شرائح فرس النهر organotypic7,8,9,10. تم استكشاف مرض باركنسون في ميسنسيفالون البطني والم المخطط، فضلا عن القشرة الجسم كالوسوم المخطط substantia nigra، شرائح organotypic11. Organotypic شريحة المخيخ الثقافات تحاكي العديد من جوانب المايلين محورا ووظائف المخيخ ونموذجا واسع الانتشار للتحقيق في استراتيجيات علاجية جديدة في التصلب المتعدد12.
ومع ذلك، أشارت الأبحاث السريرية والنماذج الحيوانية للصرع إلى أن القشرة الرهينية، التي تتألف من القشريات الهينة والهوينية، تلعب دورا في توليدالمضبوطات 13. وهكذا، تم تأسيس نموذج لتولد الصرع في شرائح الفص الحصين قرن آمون14. في ظل الحرمان التدريجي والتحكم فيه من المصل، تصور شرائح القشرة الحصين العضية المتطورة الأحداث الشبيهة بالصرع، على عكس الشرائح المماثلة التي يتم الاحتفاظ بها دائما في وسط يحتوي على المصل.
في الصرع ، كما هو الحال في العديد من الأمراض الحادة والمزمنة في الجهاز العصبي المركزي ، تفشل الرؤية العصبية المركز في توضيح الآليات الكامنة وراء ظهور المرض وتطوره. تشير الأدلة السريرية والتجريبية إلى التهاب الدماغ ، حيث تلعب الخلايا الدقيقة والخلايا الفلكية دورا مهما ، كواحدة من اللاعبين الرئيسيين الذين يساهمون في عملية الصرع. تشير التجارب الدوائية في النماذج الحيوانية للصرع إلى أنه يمكن تحقيق الآثار المضادة للصرع من خلال استهداف المسارات المؤيدة للالتهابات ، وفي الوقت الحاضر يعتبر الاشتعال العصبي خيارا جديدا لتطوير النهج العلاجية للصرع15.
هنا، ونحن نصف بدقة إعداد الثقافات شريحة عضوية القشرة قرن آمون rhinal، فضلا عن تفاصيل لتسجيل نشاط الصرع العفوية منها. ونحن نسلط الضوء على أن هذا النظام يحاكي العديد من الجوانب العصبية الدموية للصرع، كونها مناسبة بالتالي لاستكشاف دور الخلايا الدبقية والاشتعال العصبي في هذا المرض. وعلاوة على ذلك، فإنه يمثل منصة سهلة الاستخدام لفحص النهج العلاجية المحتملة للصرع.
Protocol
Representative Results
Discussion
كانت النماذج الحيوانية للصرع حاسمة لاكتشاف العديد من ال AEDs ، ومع ذلك فهي تتطلب العديد من الحيوانات ومعظمها يستغرق وقتا طويلا بسبب الفترة الكامنة لظهور النوبة. كما تم تنقيح تحريض المغنيسيوم المنخفض للنشاط الصرع في شرائح فرس النهر الحادة بدقة في الأدب3، ولكن الشرائح الحادة لها صلاحية 6-12 ساعة مما يجعل من المستحيل تقييم التغيرات على المدى الطويل. يمكن الحفاظ على شرائح Organotypic في الثقافة من أيام إلى أسابيع ، مما يسمح للتغلب على وقت البقاء القصير للشرائح الحادة ، وقد تم اقتراح نماذج من تكوين الصرع في شرائح فرس النهرالعضوية 3و7و8.
هنا نصف إعداد شرائح organotypic، التي تتألف من قشرة rhinal والحصين. هذه الشرائح تأخذ 15-20 دقيقة لإعداد لكل حيوان، بدءا من التضحية الحيوانية حتى وضع شرائح على إدراج، ويمكن الحصول على 6-8 شرائح في نصف الكرة الأرضية. يجب توخي المزيد من الحذر عند فتح نصف الكرة الأرضية لكشف قرن آمون وعند إزالة الأنسجة من ورقة التصفية بعد تشريحها. الأنسجة الزائدة فوق قرن آمون يمكن أن يعرض للخطر أيضا سلامة شريحة أثناء تشريح.
تصور شرائح الفص الوريدي الحصين العضوي نشاطا متطورا يشبه الصرع يشبه الصرع الحي. بعد أسبوع واحد في الثقافة، تصور معظم الشرائح نشاطا مختلطا بين المجاميع والاتصالات، والذي يتقدم إلى أحداث تشبه تكنولوجيا المعلومات والاتصالات فقط مع مرور الوقت في الثقافة. حتى الآن، لقد سجلنا عدد قليل من التفريغ بين الجثث في شرائح مع 2-3 أسابيع. في هذا النظام، يبدو أن النشاط الشبيه بالصرع يتطور بشكل أسرع مما هو عليه في شرائح فرس النهر العضوية. ويمكن أن يعزى هذا إلى وجود قشرة الرهين، الذي يحافظ على معظم المدخلات الوظيفية إلى قرن آمون. ولمعالجة هذه المسألة معالجة كاملة، يجري حاليا إجراء توصيف كامل للإشارات الصرعية التي تظهرها هذه الشرائح على مدى الزمن في الثقافة، مثل عدد ومدة الأحداث ال ictal، إلى جانب اتساعها وتواترها.
يمكن الحفاظ على هذا النظام في الثقافة لأكثر من ثلاثة أسابيع ، ويحاكي العديد من الارتباطات الجزيئية للصرع ، مثل موت الخلايا العصبية ، وتفعيل microglia والخلايا الفلكية وزيادة إنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات14، مما يسمح بتحديد خصائص طويلة الأجل لهذه الجوانب. كما أنه يمثل منصة فحص سهلة الاستخدام، حيث يمكن تنفيذ التدخلات الدوائية التي تستهدف مسارات خلوية محددة ويمكن اختبار الأهداف العلاجية المحتملة. مما لا شك فيه أن النظام المعروض هنا يمكن أن يساعد على زيادة تنوير آليات تكوين الصرع.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يعترفوا بوحدة التصوير البيولوجي التابعة لمعهد ميديسينا الجزيئي جواو لوبو أنتونيس، على جميع الاقتراحات المتعلقة باقتناء الصور.
وقد حصل هذا المشروع على تمويل من برنامج الاتحاد الأوروبي للأبحاث والابتكار في أفق 2020 بموجب اتفاق المنح Nº 952455، ومؤسسة الفقرة A Ciênciae Tecnologia (FCT) من خلال مشروع PTDC/MEDFAR/30933/2017، وFaculdade de Medicina da Universidade de Lisboa.
Materials
| 50 mL Centrifuge Tube, Conical Bottom | Corning | 430829 | |
| 70% Ethanol | Manuel Vieira, Lda | UN1170 | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 900A | |
| Amplifier | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Anti-C3d (goat) | R&D Systems | AF2655 | Dilute at a ratio 1:1000 |
| Anti-CD68 (mouse) | Abcam | ab31630-125ug | Dilute at a ratio 1:250 |
| Anti-GFAP (mouse) | Millipore SAS | MAB360 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | ab108539 | Dilute at a ratio 1:600 |
| Anti-NeuN (rabbit) | Werfen | 16712943S | Dilute at a ratio 1:500 |
| Artificial cerebrospinal fluid (aCSF) | Homemade | ||
| B-27™ Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Blades for scalpel handle | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | NZYTech | MB04602 | 5% BSA is used to dilute the primary antibodies. Add 0.5g BSA in 10 mL PBS. |
| Brain/Tissue Slice Chamber System | Warner Instruments | ||
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1.02382.0500 | |
| Cell culture inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE | Millipore SAS | PICM03050 | |
| Cold light source | SCHOTT | KL 300 LED | |
| Confocal laser microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Conventional incubator | Thermo Scientific Heraeus | BB15, Function Line | Set to 37 °C and 5% CO2 |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck Millipore | 1.08342.1000 | |
| D-(+)-Glucose solution, 45% in water | Sigma | G8769 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
| Dissecting microscope/magnifier | MEIJI TECHNO CO. LTD | 122285 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11057 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5 Forceps Standard Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #7 Forceps Standard Dumoxel | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Dumont Medical #7S Forceps Short Curve Inox | Fine Science Tools | 11273-22 | |
| Gentamycin stock solution, 50 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15750-037 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution (GBSS) | Biological Industries | 01-919-1A | |
| Glass Electrodes | Science Products | GB150F-10 | Round tips homemade |
| Glass Pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24020-091 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Stock solution at 2 mg/mL in PBS |
| Horse Serum, Heat Inactivated (HS) | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | |
| Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 | |
| Hydrophobic Pen | Dako | S200230-2 | |
| INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Interface chamber | Warner Instruments | BSC-HT Haas Top | |
| Iris Spatula Curved | Fine Science Tools | 10092-12 | |
| Labculture Class II Biological Safety Cabinet | HERASafe | HS 12 | |
| Lens Cleaning Paper | TIFFEN | ||
| L-Glutamine solution 200 mM (Q) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck Millipore | 1.05886.0500 | |
| Micro tube 0.5 mL, PP | SARSTEDT | 72,699 | |
| Micro tube 1.5 mL, PP | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| Micro tube 2.0 mL, PP | SARSTEDT | 72.691 | |
| Micromanipulators | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Miroscope Cover Glasses, 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 102242 | |
| Nail polish | Cliché | ||
| Neurobasal-A Medium (NBA) | Thermo Fisher Scientific | 10888-022 | |
| Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-047 | |
| Paraformaldehyde, powder | VWR Chemicals | 2,87,94,295 | |
| Peristaltic pump | Gilson | M312 | |
| Phosphate saline buffer (PBS) | Homemade. PBS with 0.5% Tween-20 (PBS-T) is used to wash slices during the immunohistochemistry assay. | ||
| Phosphate standard solutions, PO₄3- in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
| Pipette set | Gilson | P2, P10, P20, P100, P200, P1000 | |
| Platinum 5 blades | Gillette | ||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | Stock solution at 1 mg/mL in water. |
| Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 55 mm | Whatman | 1001-055 | Medium retention 11µm |
| Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 90 mm | Whatman | 1001-090 | Medium retention 11µm |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Slip Tip Insulin Syringe without Needle 1 mL | SOL-M | 161000 | |
| Sodium chloride | VWR Chemicals | 27800.360 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck Millipore | 1.06346.1000 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Merck Millipore | 1.06329.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
| Stimulator | Astro Med Inc GRASS Product Group | S48 Stimulator | |
| Student Scissors Straight SharpSharp 12cm | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| SuperFrost Plus™ Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| TC-Treated Sterile 60 x 15mm Tissue Culture Dish | Corning | CORN430166 | |
| TC-Treated Sterile 6-Wells Plates | Corning | CORN3516 | |
| Temperatue controller | MEDICAL SYSTEMS CORP. | TC-102 | |
| Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 350 μm |
| Triton X-100 | BDH | 14630 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 |
References
- Fisher, R. S., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51, 899-908 (2010).
- Loscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20, 359-368 (2011).
- Heinemann, U., Kann, O., Schuma, S., Pitkänen, A., Schwartzkroin, P. A., Moshé, S. L. An overview of in vitro seizure models in acute and organotypic slices. Models of seizures and epilepsy. , 35-44 (2006).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today: Targets. 10, 993-1000 (2005).
- Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: a model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochemical Research. 30, 1521-1528 (2005).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. CNS Neurological Disorders Drug Targets. 4, 435-452 (2005).
- Dyhrfjeld-Johnsen, J., Berdichevsky, Y., Swiercz, W., Sabolek, H., Staley, K. J. Interictal spikes precede ictal discharges in an organotypic hippocampal slice culture model of epileptogenesis. Journal of Clinical Neurophysiology. 27, 418-424 (2010).
- Chong, S. A., et al. Intrinsic Inflammation Is a Potential Anti-Epileptogenic Target in the Organotypic Hippocampal Slice Model. Neurotherapeutics. 15, 470-488 (2018).
- Li, Q., Han, X., Wang, J. Organotypic hippocampal slices as models for stroke and traumatic brain injury. Molecular Neurobiology. 53 (6), 4226-4237 (2016).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5, 19-33 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Doussau, F., Dupont, J. L., Neel, D., Schneider, A., Poulain, B., Bossu, J. L. Organotypic cultures of cerebellar slices as a model to investigate demyelinating disorders. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (10), 1011-1022 (2017).
- Vismer, M. S., Forcelli, P. A., Skopin, M. D., Gale, K., Koubeissi, M. Z. The piriform, perirhinal, and entorhinal cortex in seizure generation. Frontiers in Neural Circuits. 9, 27 (2015).
- Magalhães, D. M., Pereira, N., Rombo, D. M., Beltrão-Cavacas, C., Sebastião, A. M., Valente, C. A. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices – a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15, 203 (2018).
- Ravizza, T., Balosso, S., Vezzani, A. Inflammation and prevention of epileptogenesis. Neuroscience Letters. 497 (3), 223-230 (2011).
- Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541, 481-487 (2017).
- Wu, T. Complement C3 is activated in human AD brain and is required for neurodegeneration in mouse models of amyloidosis and tauopathy. Cell Reports. 28 (8), 2111-2123 (2019).
- Hartmann, K., et al. Complement 3+-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia. Acta Neuropathologica Communications. 7, 83 (2019).
- Nilsson, U. R., Funke, L., Nilsson, B., Ekdahl, K. N. Two conformational forms of target-bound iC3b that distinctively bind complement receptors 1 and 2 and two specific monoclonal antibodies. Upsala Journal of Medical Sciences. 116, 26-33 (2011).
