מודל של אפילפטוגנזה בתרבויות פרוסות קליפת המוח-היפוקמפוס של רינאל קליפת המוח
Summary
כאן, אנו מתארים את הכנת פרוסות אורגנוטיפיק קליפת המוח הריאנלית-היפוקמפוס. תחת קיפוח הדרגתי ומבוקר של סרום, פרוסות אלה מתארות אירועים מתפתחים דמויי אפילפטיים ויכולים להיחשב מודל אקס ויוו של אפילפטוגנזה. מערכת זו מייצגת כלי מצוין לניטור הדינמיקה של פעילות ספונטנית, כמו גם להערכת ההתקדמות של תכונות נוירואינפלמטוריות לאורך כל מהלך אפילפטוגנזה.
Abstract
תרבויות פרוסות Organotypic כבר בשימוש נרחב מודל הפרעות מוחיות נחשבים פלטפורמות מצוינות להערכת הפוטנציאל neuroprotective וטיפולי של התרופה. פרוסות Organotypic מוכנות מרקמה מוסברת ומייצגות סביבת אקס ויוו רב-תאית מורכבת. הם משמרים את הציטו-ארכיטקטורה התלת מימדית והסביבה המקומית של תאי המוח, שומרים על הקישוריות העצבית ועל האינטראקציה ההדדית בין הנוירונים לגליה. פרוסות אורגנוטיפיות בהיפוקמפוס נחשבות מתאימות לחקור את המנגנונים הבסיסיים של אפילפטוגנזה, אך מחקר קליני ומודלים של בעלי חיים של אפילפסיה הראו כי קליפת המוח הריאנלית, המורכבת מקליפת המוח הפרירינלית והאנטורינית, ממלאת תפקיד רלוונטי בדור ההתקפים.
כאן, אנו מתארים את הכנת פרוסות אורגנוטיפיק קליפת המוח הריאנלית-היפוקמפוס. הקלטות של פעילות ספונטנית מאזור CA3 תחת זלוף עם מדיום צמיחה מלא, בטמפרטורה פיזיולוגית ובהיעדר מניפולציות תרופתיות, הראו כי פרוסות אלה מתארות אירועים מתפתחים דמויי אפילפטיים לאורך זמן בתרבות. מוות תאי מוגבר, באמצעות propidium יודיד ספיגת asssay, גליוזיס, מוערך עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית, נצפתה גם. הגישה הניסיונית שהוצגה מדגישה את הערך של תרבויות פרוסות קליפת המוח-היפוקמפוס rhinal כפלטפורמה לחקר הדינמיקה וההתקדמות של אפילפטוגנזה ולסנן מטרות טיפוליות פוטנציאליות עבור פתולוגיה זו של המוח.
Introduction
אפילפסיה, אחת ההפרעות הנוירולוגיות הנפוצות ביותר בעולם, מאופיינת בהתרחשות תקופתית ובלתי צפויה של פעילות עצבית מסונכרנת ומוגזמת במוח. למרות תרופות אנטי אפילפטיות שונות (AEDs) זמין, שליש מהחולים עם אפילפסיה הם עקשן לטיפול1 וממשיכים לחוות התקפים וירידה קוגניטיבית. יתר על כן, AEDs זמין לעכב קוגניציה בשל פעולות כלליות יחסית שלהם על פעילות עצבית. אפילפטוגנזה קשה ללמוד בבני אדם, בשל פציעות אפילפטוגניות מרובות והטרוגניות, תקופות סמויות ארוכות שנמשכות חודשים עד עשרות שנים, ואת ההשפעות המטעות של טיפול נוגד פרוצים לאחר ההתקף הספונטני הראשון.
זיהוי של סוכנים טיפוליים פוטנציאליים לטיפול באפילפסיה התאפשר עקב מודלים של בעלי חיים של אפילפסיה: 1) מודלים גנטיים, המשתמשים בבעלי חיים נטייה גנטית שבהם התקפים מתרחשים באופן ספונטני או בתגובה לגירוי חושי; 2) מודלים של התקפים הנגרמים על ידי גירוי חשמלי; ו -3) מודלים תרופתיים של אינדוקציה התקפים המשתמשים pilocarpine (אגוניסט קולטן muscarinic), kainate (אגוניסט קולטן kainate) או 4-aminopyridine (חוסם ערוץ אשלגן), בין היתר. מודלים אלה היו חיוניים בהבנת השינויים ההתנהגותיים, כמו גם מנגנונים מולקולריים ותאיים שבבסיס האפילפסיה, והם הובילו לגילוי של AEDs רבים2.
ההכנות Ex vivo הם גם כלי רב עוצמה לחקור את המנגנונים הבסיסיים אפילפטוגנזה ו ictogenesis. פרוסות היפוקמפוס חריפות, המאפשרות מחקרים אלקטרופיזיולוגיים של תאים חיים על פני תקופה של 6-12 שעות, ופרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפי שניתן לשמר באינקובטור על פני תקופה של ימים או שבועות שימשו בהרחבה במחקרים על פעילות אפילפטיפורם3.
פרוסות מוח אורגנוטיפיות מוכנות מרקמה מושתלת ומייצגות מודל תלת מימדי פיזיולוגי של המוח. פרוסות אלה משמרות את הציטו-ארכיטקטורה של אזור העניין וכוללות את כל תאי המוח ואת התקשורת הבין-תאית שלהם4. האזור הנפוצץ ביותר עבור תרבויות organotypic לטווח ארוך הוא ההיפוקמפוס, כמו אזור זה מושפע אובדן עצבי בתנאים ניווניים מרובים. הם היו בשימוש נרחב כדי מודל הפרעות מוחיות נחשבים כלים מצוינים להערכת הפוטנציאל neuroprotective וטיפולי של התרופה5,6. מודלים של אפילפטוגנזה, שבץ ורעילות הנגרמת על ידי Aβ תוארו בפרוסות אורגנוטיפיות בהיפוקמפוס7,8,9,10. מחלת פרקינסון נחקרה במזנספלון גחוני ובסטריאטום, כמו גם בקליפת המוח-קורפוס כפיסטום-סטריאטום-סובסטנציה ניגרה, פרוסות אורגנוטיפיות11. תרבויות פרוסת המוח הקטן Organotypic לחקות היבטים רבים של myelination אקסון ותפקודים מוחיים והם מודל נפוץ לחקור אסטרטגיות טיפוליות חדשניות בטרשת נפוצה12.
עם זאת, מחקר קליני ומודלים של בעלי חיים של אפילפסיה הציעו כי קליפת המוח הריאנאלית, המורכבת על ידי קליפות קליפת המוח הפרירינלית והאנטוריניאלית, ממלאת תפקיד בדור ההתקפים13. לכן, מודל של אפילפטוגנזה בקליפת המוח הריאנאלית-היפוקמפוס פרוסות organotypic הוקמה14. תחת קיפוח הדרגתי ומבוקר של סרום, פרוסות אורגנוטיפיות של קליפת המוח הריאנלית-היפוקמפוס מתארות אירועים מתפתחים דמויי אפילפטיות, שלא כמו פרוסות אנלוגיות שתמיד נשמרות במדיום המכיל סרום.
באפילפסיה, כמו במחלות חריפות וכרוניות רבות של מערכת העצבים המרכזית, הראייה הנוירוצנטרית אינה מצליחה להבהיר את המנגנונים שבבסיס הופעת המחלה והתקדמותה. ראיות קליניות וניסיוניות מצביעות על דלקת במוח, שבה מיקרוגליה ואסטרוציטים ממלאים תפקיד רלוונטי, כאחד משחקני המפתח התורמים לתהליך האפילפטי. ניסויים תרופתיים במודלים של בעלי חיים של אפילפסיה מראים כי השפעות אנטי אפילפטוגניות ניתן להשיג על ידי מיקוד מסלולים פרו דלקתיים, וכיום neuroinflammation נחשב כאפשרות חדשנית לפיתוח גישות טיפוליות עבור אפילפסיה15.
כאן, אנו מתארים ביסודיות את הכנת תרבויות פרוסות קליפת המוח-היפוקמפוס rhinal, כמו גם את הפרטים לתיעוד פעילות אפילפטיפורמית ספונטנית מהם. אנו מדגישים כי מערכת זו מחקה מספר היבטים נוירו-אינפלציה של אפילפסיה, ובכך מתאים לחקור את התפקיד של תאי גליה ו neuroinflammation בפתולוגיה זו. יתר על כן, הוא מייצג פלטפורמה קלה לשימוש להקרנה של גישות טיפוליות פוטנציאליות לאפילפסיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מודלים של בעלי חיים של אפילפסיה היו חיוניים לגילוי של AEDs רבים, אולם הם דורשים בעלי חיים רבים ורובם זמן רב בשל התקופה הסמויה להתפרצות התקפים. אינדוקציה מגנזיום נמוך של פעילות אפילפטיפורם בפרוסות חריפה ההיפוקמפוס גם תוקן ביסודיות בספרות3, אבל פרוסות חריפות יש כדאיות 6-12 שעות מה שהופך את זה בלתי אפשרי להעריך שינויים ארוכי טווח. פרוסות organotypic ניתן לשמור בתרבות מימים עד שבועות, המאפשר להתגבר על זמן הכדאיות הקצרה של פרוסות חריפות, מודלים של אפילפטוגנזה בפרוסות היפוקמפוס organotypic הוצעו3,7,8.
כאן אנו מתארים את הכנת פרוסות organotypic, הכולל את קליפת המוח rhinal ואת ההיפוקמפוס. לפרוסות אלה לוקח 15-20 דקות להכין לכל בעל חיים, החל מהקרבת בעלי חיים ועד להצבת פרוסות על התוספות, וניתן להשיג 6-8 פרוסות לכל חצי כדור. יש לנקוט משנה זהירות בעת פתיחת חצי הכדור כדי לחשוף את ההיפוקמפוס וכאשר מסירים את הרקמה מנייר הסינון לאחר ההסתעפות. עודף רקמה מעל ההיפוקמפוס יכול גם לסכן את שלמות הפרוסה במהלך ההחתכה.
פרוסות אורגנוטיפיות של קליפת המוח הריאנלית-היפוקמפוס מתארות פעילות מתפתחת דמוית אפילפטית הדומה לאפילפסיה של vivo. לאחר שבוע בתרבות, רוב הפרוסות מתארות פעילות מעורבת דמוית ictal, אשר מתקדמת לאירועים דמויי ictal בלבד עם זמן בתרבות. עד כה, רשמנו כמה הפרשות interictal בפרוסות עם 2-3 שבועות. במערכת זו, פעילות דמוית אפילפטית נראה לפתח מהר יותר מאשר פרוסות היפוקמפוס organotypic. ניתן לייחס זאת לנוכחות קליפת המוח הריאנלית, המשמרת את רוב הקלט הפונקציונלי להיפוקמפוס. כדי לטפל באופן מלא בבעיה זו, אפיון מלא של האותות האפילפטיים המוצגים על ידי פרוסות אלה לאורך זמן בתרבות, כגון מספר ומשך האירועים ictal, יחד עם משרעת ותדירות שלהם, מתבצע כעת.
מערכת זו יכולה להישמר בתרבות במשך יותר משלושה שבועות, ומחקה קורלציות מולקולריות רבות של אפילפסיה, כגון מוות עצבי, הפעלה של microglia ואסטרוציטים וייצור מוגבר של ציטוקינים פרו דלקתיים14, המאפשר אפיון ארוך טווח של היבטים אלה. הוא מייצג גם פלטפורמת סינון קלה לשימוש, שבה ניתן ליישם התערבויות תרופתיות המכוונות למסלולים תאיים ספציפיים וניתן לבדוק מטרות טיפוליות פוטנציאליות. אין ספק, המערכת המוצגת כאן יכולה לעזור להאיר עוד יותר את המנגנונים של אפילפטוגנזה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר ביחידת הביו-הדמיה של המכון המולקולרי של מדיצ’ינה ז’ואאו לובו אנטונס, על כל ההצעות הנוגעות לרכישת תדמית.
פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענק Nº 952455, Fundação para a Ciênciae Tecnologia (FCT) באמצעות פרויקט PTDC/MEDFAR/30933/2017 ופקולדה דה מדיצ’ינה דה אוניברסיטת ליסבון.
Materials
| 50 mL Centrifuge Tube, Conical Bottom | Corning | 430829 | |
| 70% Ethanol | Manuel Vieira, Lda | UN1170 | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 900A | |
| Amplifier | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Anti-C3d (goat) | R&D Systems | AF2655 | Dilute at a ratio 1:1000 |
| Anti-CD68 (mouse) | Abcam | ab31630-125ug | Dilute at a ratio 1:250 |
| Anti-GFAP (mouse) | Millipore SAS | MAB360 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | ab108539 | Dilute at a ratio 1:600 |
| Anti-NeuN (rabbit) | Werfen | 16712943S | Dilute at a ratio 1:500 |
| Artificial cerebrospinal fluid (aCSF) | Homemade | ||
| B-27™ Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| Blades for scalpel handle | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | NZYTech | MB04602 | 5% BSA is used to dilute the primary antibodies. Add 0.5g BSA in 10 mL PBS. |
| Brain/Tissue Slice Chamber System | Warner Instruments | ||
| Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1.02382.0500 | |
| Cell culture inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE | Millipore SAS | PICM03050 | |
| Cold light source | SCHOTT | KL 300 LED | |
| Confocal laser microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Conventional incubator | Thermo Scientific Heraeus | BB15, Function Line | Set to 37 °C and 5% CO2 |
| D(+)-Glucose monohydrate | Merck Millipore | 1.08342.1000 | |
| D-(+)-Glucose solution, 45% in water | Sigma | G8769 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
| Dissecting microscope/magnifier | MEIJI TECHNO CO. LTD | 122285 | |
| Donkey anti-goat IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11057 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilute at a ratio 1:200 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute at a ratio 1:500 |
| Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5 Forceps Standard Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #7 Forceps Standard Dumoxel | Fine Science Tools | 11271-30 | |
| Dumont Medical #7S Forceps Short Curve Inox | Fine Science Tools | 11273-22 | |
| Gentamycin stock solution, 50 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15750-037 | |
| Gey’s Balanced Salt Solution (GBSS) | Biological Industries | 01-919-1A | |
| Glass Electrodes | Science Products | GB150F-10 | Round tips homemade |
| Glass Pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24020-091 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Stock solution at 2 mg/mL in PBS |
| Horse Serum, Heat Inactivated (HS) | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | |
| Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 | |
| Hydrophobic Pen | Dako | S200230-2 | |
| INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 | |
| Interface chamber | Warner Instruments | BSC-HT Haas Top | |
| Iris Spatula Curved | Fine Science Tools | 10092-12 | |
| Labculture Class II Biological Safety Cabinet | HERASafe | HS 12 | |
| Lens Cleaning Paper | TIFFEN | ||
| L-Glutamine solution 200 mM (Q) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Merck Millipore | 1.05886.0500 | |
| Micro tube 0.5 mL, PP | SARSTEDT | 72,699 | |
| Micro tube 1.5 mL, PP | SARSTEDT | 72.690.001 | |
| Micro tube 2.0 mL, PP | SARSTEDT | 72.691 | |
| Micromanipulators | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Miroscope Cover Glasses, 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 102242 | |
| Nail polish | Cliché | ||
| Neurobasal-A Medium (NBA) | Thermo Fisher Scientific | 10888-022 | |
| Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-047 | |
| Paraformaldehyde, powder | VWR Chemicals | 2,87,94,295 | |
| Peristaltic pump | Gilson | M312 | |
| Phosphate saline buffer (PBS) | Homemade. PBS with 0.5% Tween-20 (PBS-T) is used to wash slices during the immunohistochemistry assay. | ||
| Phosphate standard solutions, PO₄3- in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
| Pipette set | Gilson | P2, P10, P20, P100, P200, P1000 | |
| Platinum 5 blades | Gillette | ||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | Stock solution at 1 mg/mL in water. |
| Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 55 mm | Whatman | 1001-055 | Medium retention 11µm |
| Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 90 mm | Whatman | 1001-090 | Medium retention 11µm |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Slip Tip Insulin Syringe without Needle 1 mL | SOL-M | 161000 | |
| Sodium chloride | VWR Chemicals | 27800.360 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck Millipore | 1.06346.1000 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Merck Millipore | 1.06329.1000 | |
| Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
| Stimulator | Astro Med Inc GRASS Product Group | S48 Stimulator | |
| Student Scissors Straight SharpSharp 12cm | Fine Science Tools | 91402-12 | |
| SuperFrost Plus™ Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| TC-Treated Sterile 60 x 15mm Tissue Culture Dish | Corning | CORN430166 | |
| TC-Treated Sterile 6-Wells Plates | Corning | CORN3516 | |
| Temperatue controller | MEDICAL SYSTEMS CORP. | TC-102 | |
| Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 350 μm |
| Triton X-100 | BDH | 14630 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 |
References
- Fisher, R. S., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51, 899-908 (2010).
- Loscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20, 359-368 (2011).
- Heinemann, U., Kann, O., Schuma, S., Pitkänen, A., Schwartzkroin, P. A., Moshé, S. L. An overview of in vitro seizure models in acute and organotypic slices. Models of seizures and epilepsy. , 35-44 (2006).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today: Targets. 10, 993-1000 (2005).
- Holopainen, I. E. Organotypic hippocampal slice cultures: a model system to study basic cellular and molecular mechanisms of neuronal cell death, neuroprotection, and synaptic plasticity. Neurochemical Research. 30, 1521-1528 (2005).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. CNS Neurological Disorders Drug Targets. 4, 435-452 (2005).
- Dyhrfjeld-Johnsen, J., Berdichevsky, Y., Swiercz, W., Sabolek, H., Staley, K. J. Interictal spikes precede ictal discharges in an organotypic hippocampal slice culture model of epileptogenesis. Journal of Clinical Neurophysiology. 27, 418-424 (2010).
- Chong, S. A., et al. Intrinsic Inflammation Is a Potential Anti-Epileptogenic Target in the Organotypic Hippocampal Slice Model. Neurotherapeutics. 15, 470-488 (2018).
- Li, Q., Han, X., Wang, J. Organotypic hippocampal slices as models for stroke and traumatic brain injury. Molecular Neurobiology. 53 (6), 4226-4237 (2016).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5, 19-33 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Doussau, F., Dupont, J. L., Neel, D., Schneider, A., Poulain, B., Bossu, J. L. Organotypic cultures of cerebellar slices as a model to investigate demyelinating disorders. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (10), 1011-1022 (2017).
- Vismer, M. S., Forcelli, P. A., Skopin, M. D., Gale, K., Koubeissi, M. Z. The piriform, perirhinal, and entorhinal cortex in seizure generation. Frontiers in Neural Circuits. 9, 27 (2015).
- Magalhães, D. M., Pereira, N., Rombo, D. M., Beltrão-Cavacas, C., Sebastião, A. M., Valente, C. A. Ex vivo model of epilepsy in organotypic slices – a new tool for drug screening. Journal of Neuroinflammation. 15, 203 (2018).
- Ravizza, T., Balosso, S., Vezzani, A. Inflammation and prevention of epileptogenesis. Neuroscience Letters. 497 (3), 223-230 (2011).
- Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541, 481-487 (2017).
- Wu, T. Complement C3 is activated in human AD brain and is required for neurodegeneration in mouse models of amyloidosis and tauopathy. Cell Reports. 28 (8), 2111-2123 (2019).
- Hartmann, K., et al. Complement 3+-astrocytes are highly abundant in prion diseases, but their abolishment led to an accelerated disease course and early dysregulation of microglia. Acta Neuropathologica Communications. 7, 83 (2019).
- Nilsson, U. R., Funke, L., Nilsson, B., Ekdahl, K. N. Two conformational forms of target-bound iC3b that distinctively bind complement receptors 1 and 2 and two specific monoclonal antibodies. Upsala Journal of Medical Sciences. 116, 26-33 (2011).
