JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Создание и содержание гнотобиотических американских тараканов (Periplaneta americana)

Published: May 28, 2021
doi:
10.3791/61316
, ,
1Department of Microbiology,University of Georgia

Summary

Этот протокол используется при установлении и поддержании гнотобиотических американских тараканов(Periplaneta americana)путем поверхностной стерилизации яиц (oothecae) до вылупления. Эти гнотобиотические насекомые содержат вертикально передаваемые Blattabacterium endosymbionts, но имеют аксеновые кишки.

Abstract

Гнотобиотические животные являются мощным инструментом для изучения контроля над структурой и функцией микробиома. Здесь представлен протокол по установлению и содержанию гнотобиотических американских тараканов(Periplaneta americana). Этот подход включает в себя встроенные проверки стерильности для постоянного контроля качества. Гнотобиотические насекомые определяются здесь как тараканы, которые все еще содержат вертикально передаваемый эндосимбионт(Blattabacterium),но не имеют других микробов, которые обычно находятся на их поверхности и в их пищеварительном тракте. Для этого протокола яйцеклетки (oothecae) удаляются из (нестерильной) колонии и стерилизуются на поверхности. После сбора и стерилизации оотеки инкубируют при 30 °C в течение примерно 4-6 недель на агаре инфузии мозга и сердца (BHI) до тех пор, пока они не вылупятся или не будут удалены из-за загрязнения. Вылупившиеся нимфы переносятся в колбу Эрленмейера, содержащую пол BHI, стерильную воду и стерильную крысиную пищу. Чтобы гарантировать, что нимфы не являются обустройством микробов, которые не могут расти на BHI в данных условиях, дополнительная мера контроля качества использует полиморфизм ограничения длины фрагмента (RFLP) для тестирования на неэндосимбиотические микробы. Гнотобиотические нимфы, полученные с использованием этого подхода, могут быть инокулированы простыми или сложными микробными сообществами и использованы в качестве инструмента в исследованиях кишечного микробиома.

Introduction

Гнотобиотические животные оказались бесценными инструментами для исследований микробиома1,2,3. Животные без микробов и с определенной флорой позволили прояснить взаимодействия хозяина и микроба, включая иммунологические реакции хозяина, созревание эпителия кишечника и метаболизм хозяина1,4,5,6,7. Гнотобиотические животные, привитые упрощенным сообществом, также помогли в более полном понимании взаимодействий микроб-микроб в кишечном сообществе, в частности, в разгадке перекрестных кормлений и антагонистических отношений8,9,10,11. В настоящее время предпочтительной модельной системой для исследований в микробиоме кишечника млекопитающих является мышиная модель. Хотя эта система была жизненно важна для открытий, описанных выше, ключевым недостатком является связанная с этим стоимость. Для создания и обслуживания гнотобиотического объекта необходимо специализированное оборудование и высококвалифицированные технические специалисты. Это, в сочетании с дополнительной осторожностью, которая должна быть уделена каждому аспекту содержания гнотобиотических животных, приводит к тому, что гнотобиотическое животное стоит в десять-двадцать раз дороже, чем стандартное животное модели12. Из-за высоких затрат многие исследователи могут быть не в состоянии позволить себе гнотобиотическую модель мыши. Кроме того, в то время как мышиные модели могут быть наиболее широко принятым выбором для исследований, направленных на перевод на здоровье человека, все еще существует много физиологических и морфологических различий между кишечником человека и мыши13. Очевидно, что ни одна единичная модель не является достаточной, чтобы ответить на постоянно растущее число вопросов, касающихся многих аспектов кишечного микробиома.

Модели насекомых являются более дешевой альтернативой из-за их более низкой стоимости обслуживания по сравнению с видами млекопитающих. Обширные исследования без микробов и гнотобиотиков на различных видах насекомых привели к разработке нескольких широко используемых моделей. Комары и дрозофилы являются общими моделями работы без микробов из-за их актуальности для глобальных заболеваний и генетической трактовки14,15. Другой новой модельной системой является система медоноснойпчелы (Apis mellifera),учитывая ее важность в исследованиях опыления и социальности16. Однако многим из этих широко используемых насекомых не хватает таксономической сложности, наблюдаемой в сообществах кишечника млекопитающих17,что ограничивает их способность моделировать взаимодействия более высокого порядка. Мало того, что общее разнообразие микробов, обнаруженных в кишечнике американских тараканов, больше похоже на млекопитающих, но многие из микробов, присутствующих в кишечнике таракана, принадлежат к семействам и типам, которые обычно встречаются в кишечной микробиоте млекопитающих и людей18. Задворка таракана также функционально аналогична толстой кишке млекопитающих, так как представляет собой ферментационную камеру, плотно заполненную бактериями для помощи в извлечении питательных веществ19,20. Наконец, всеядный характер тараканов допускает разнообразие режимов питания, которые были бы невозможны с диетологами.

Американские тараканы могут быть полезной модельной системой для понимания микробных сообществ кишечника в высших организмах, но статус таракана как вредителя также делает эту систему актуальной для борьбы с вредителями21. Использование фундаментальных знаний о влиянии кишечного сообщества на здоровье и физиологию тараканов помогает в разработке новых методов борьбы с вредителями.

Целью этого метода является подробное описание становления и содержания гнотобиотических американских тараканов(Periplaneta americana),но этот протокол может быть использован для генерации нимф любого яйцекладущего таракана. Он включает в себя метод эффективного, неинвазивного сбора зрелых оотеков и неразрушающий метод мониторинга гнотобиотического статуса насекомых22,23,24. В то время как предыдущие методы достижения и поддержания гнотобиотических тараканов описывают коллекцию ootheca23,24,25,26,27,зрелость оотеки либо интерпретируется в терминах видоспецифических сигналов (в Blattella germanica22,24,25),либо явно не описана27,28,что затрудняет реализацию для тех, кто не знаком с системой. Поскольку описанный здесь способ использует естественно упавшие оотеки, погрешность преждевременного удаления яйцеклеток отсутствует. Этот протокол содержит как зависящие от культуры, так и зависящие от культуры методы контроля качества, а зависящий от культуры метод не требует жертвоприношения насекомых. Наконец, этот метод объединяет информацию из нескольких исследований гнотобиотических тараканов для создания единого всеобъемлющего протокола со всей необходимой информацией для достижения и поддержания гнотобиотических тараканов.

Protocol

1. Подготовка материалов Сохранение стайных таракановых культурПРИМЕЧАНИЕ: Есть много способов выращивания этих крепких насекомых. Специфика обеспечения жильем и водой может быть разной в зависимости от доступных материалов (т.е. картонных коробок для яиц вместо картонных тюбиков). Следующий протокол стерилизации будет работать для любой установки резервуара для запасов. Распределите достаточно подстилки из древесной щепа в аквариуме объемом 37,85 л (10 галлонов), чтобы покрыть дно резервуара примерно 1-дюймовым постельным бельем. Подготовьте корпус, разрезав (плоский) картон до 2 в х 4 кусочков. Вставьте кусочки картона в картонные трубки (например, трубки для туалетной бумаги) и сложйте трубки на одном конце резервуара(рисунок 1). Размажьте тонкий слой вазелина на верхних двух дюймах внутренней части резервуара, чтобы предотвратить побег насекомых.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы правильно покрыли внутренние углы резервуара. Добавьте тараканов, перенеся (занятые) картонные трубки из предыдущего резервуара, встряхнув их, чтобы освободить их обитателей. За каждую передачу перемещайте 100−200 тараканов смешанного возраста. Добавьте корм для собак (20−30 штук), следите за количеством корма для собак в баке и заправляйте его при низком уровне. Установите посуду для воды. Наполните небольшой пластиковый многоразовый контейнер для пищевых продуктов двойной дистилляцией (ddH2O). Вырежьте целлюлозные губки и отверстия в крышке пищевого контейнера примерно одинакового размера.ПРИМЕЧАНИЕ: Целлюлозные губки предотвращают утопление тараканов в посуде с водой. Вставьте губки в отверстия в крышке и поместите крышку на заполненный контейнер. Поместите контейнер в бак и заправляйте его, когда он низкий. Накройте резервуар хлопчатобумажной тканью и закрепите его на месте резинкой. По мере того, как в аквариумах начинают накапливаться чрезмерное количество фрассов и туш насекомых, устанавливают новые резервуары и перегоняют тараканов.ПРИМЕЧАНИЕ: Резервуары обычно переносятся каждые 6 месяцев. Любые оставшиеся тараканы/яйца в списанных резервуарах для хранения усыпляются путем замораживания при -20 °C в течение 1 ч, а содержимое резервуара для запасов затем переносится в автоклавный мешок и автоклавируется (1 ч, гравитационный цикл) перед удалением. Резервуары для запасов стерилизуются 2% отбеливателем между использованием. Продезинфицируйте вторичный контейнер.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот контейнер не включает фильтр, но вместо этого обеспечивает свободный воздухообмен. Распылите внутреннюю часть крышки и дна 2% отбеливателем и дайте им впитаться в течение 10 минут. Вытрите отбеливатель чистым бумажным полотенцем. Обрызгайте внутреннюю часть крышки и дно 70% этанолом и вытрите насухо чистым бумажным полотенцем. Замените крышку до использования. Сделайте наклоны и колбы BHI для инкубации яиц и содержания нимф. Приготовьте BHI согласно инструкции на упаковке, добавив 2% агара. Вскипятить раствор БХИ-агара до осветления. Для наклонов переложите 5 мл аликвот в стеклянные пробирки и колпачок размером 18 мм x 150 мм. Стерилизовать через автоклав (время стерилизации = 20 мин, жидкий цикл). Поместите автоклавные трубки под углом 45° для охлаждения в наклоны. После затвердевания храните в холодильнике до использования, чтобы предотвратить высыхание. Для колбы переложите 10 мл аликвот вареного раствора BHI-агара в колбы Эрленмейера по 250 мл, чтобы полностью покрыть дно колбы. Накройте колбу фольгой и стерилизуйте через автоклав (20 мин, жидкостный цикл). Дайте автоклавным колбам остыть и охладить до использования, чтобы предотвратить высыхание.ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой установки не требуется воздушный фильтр. Крышка из фольги достаточна для обеспечения газообмена, предотвращая загрязнение от потока открытого воздуха. Стерилизация через автоклав: автоклавируемый крысиный чау-чау, разбитый на половинные размеры (~ 1/2 дюйма кусков) в покрытом фольгой мукере (время стерилизации = 1 ч, гравитационный цикл), ddH2O в бутылке с крышкой (время стерилизации = 20 мин, жидкий цикл) и щипцы в покрытом фольгой керах (время стерилизации = 20 мин, гравитационный цикл).ПРИМЕЧАНИЕ: Не переполняйте крысиный чау-чау. Пеллеты будут набухать в автоклаве. Установите резервуар «родильное отделение».ПРИМЕЧАНИЕ: Этот резервуар содержит те же материалы, что и резервуары для скота (картонные трубки, посуда для воды с губками, корм для собак, подстилка из древесной щепы; см. Рисунок 1)и должен быть пуст от тараканов, если он не передан для сбора оотеков (см. раздел 2). Увлажните инкубатор, приготовив заклинивание, полное перенасыщенного раствора хлорида натрия (NaCl). Готовят этот раствор, добавляя 37 г NaCl на 100 мл ddH2O и перемешивая до растворения.ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, 500 мл насыщенного раствора соли обычно увлажняет инкубатор с размерами камеры 51 см х 46 см х 46 см (В х Ш х Г) в течение примерно месяца, прежде чем необходимо добавить больше воды. 2. Коллекция оотека Перенесите самок (в любом количестве, соответствующем запланированным экспериментам), несущих оотеки(рисунок 2),из резервуара для скота в «родильное отделение» с помощью щипцов для перемещения картонных трубок, содержащих гравидных самок. Если картонная трубка содержит несколько насекомых в дополнение к самке гравида, сначала вытряхните трубку в дополнительный пластиковый контейнер, окольцованный вазелином, а затем предложите целевому насекому забраться обратно в картонную трубку в одиночку. Перенесите самок обратно в резервуар для запаса, как только они сбросят свои оотеки. Извлеките оотеки из подстилки в резервуаре с помощью щипцов.ПРИМЕЧАНИЕ: Oothecae часто выпадают в течение 24 часов после передачи самки. 3. Очистка отека Добавьте оотеки в 5 мл центрифужную трубку, содержащую 3 мл додецилсульфата натрия (SDS). Вихрь на 10 с. Повторите второй этап промывки с помощью центрифужной трубки, содержащей свежий SDS.ПРИМЕЧАНИЕ: На 3 мл SDS можно использовать до пяти оотеков. Используя деликатную салфетку, аккуратно очистите поверхность каждой оотеки, чтобы удалить мусор. Для помощи в тщательной очистке может быть добавлено больше SDS. Поместите очищенные оотеки в весовую лодку до готовности к стерилизации.ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол может быть приостановлен, но оставление оотеков в среде с низкой влажностью в течение длительных периодов времени (от дней до недель) приведет к их обезвоживанию и потере жизнеспособности. 4. Стерилизация и инкубация оотека Стерильная вода «Аликвот» для постстерилизационного промывки. Для каждой оотеки, которая будет стерилизована, заполните две центрифужные трубки по 1,5 мл 1 мл стерильной воды. Добавьте 10 мкл концентрированного (32%) раствор перуксусной кислоты до 3,2 мл ddH2O в центрифужной трубке 5 мл для создания 0,1% раствора для стерилизации. Колпачок и инвертирование несколько раз перемешать.ВНИМАНИЕ: Прожечная кислота вредна при контакте с кожей или легкими. Разбавить в вытяжке.ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно быть сделано в тот же день, что и стерилизация. Если развести заранее, раствор быстро разложится и поэтому не будет должным образом стерилизоваться. До пяти очищенных оотека могут быть стерилизовано в 3,2 мл разбавленной кислоты. Поместите (до пяти) очищенные оотеки в 0,1% растворе перуксусной кислоты на 5 мин. Переворачивать трубку несколько раз каждые 60 с. В ламинарной проточной вытяжке используйте стерильные щипцы для переноса каждой оотеки в собственную центрифужную трубку с аликвотированной стерильной промывочной водой (этап 4.1). Переверяйте несколько раз, чтобы перемешать. Повторите для второго полосканий, затем перенесите каждую промытую оотеку на свой собственный наклон BHI с помощью стерильных щипцов. Поместите сланцевые области в стерилизованную вторичную емкость. Переместите контейнер в увлажненный инкубатор при 30 °C в течение 4−5 недель до вылупления.ПРИМЕЧАНИЕ: Наклоны могут удерживаться в вертикальном положении с помощью небольшой стойки для пробирок или среднего/маленького клюва. Регулярно проверяйте наклоны (1−2 раза в неделю). Если на агале появляется грибковый или бактериальный рост колонии, удалите загрязненный уклон. Когда приближается четырехнедельная точка времени, проверяйте наклоны каждый день.ПРИМЕЧАНИЕ: После вылупления нимфы могут выживать до нескольких недель только на BHI, но не будут расти оптимально. 5. Содержание гнотобиотических нимф В ламинарной проточной вытяжке асептически переложите гранулу стерилизованного крысиного чау в подготовленную колбу BHI (из шага 1.3.3) со стерильными щипцами. В качестве проверки стерильности поместите колбу во вторичный контейнер в инкубатор при 30 °C в течение 24 ч и не используйте при появлении роста. Добавьте нимф в колбу BHI со стерильными пищевыми гранулами. Вытряхните их из их наклона BHI и позвольте им упасть в колбу в ламинарной вытяжке.ПРИМЕЧАНИЕ: Нимфы не имеют тяги на стеклянных стенках пробирки. Встряхивание трубки, чтобы сбить их с наклона, а затем опрокидывание трубки, чтобы они могли скользить вниз по стеклу в колбу, является эффективным. В то время как нимфы могут быть перенесены с помощью щипцов, риск смертельной травмы высок. Водяные нимфы с 300 мкл стерильной воды один раз в неделю в ламинарной вытяжке путем пипетки непосредственно на пол BHI колбы. Когда фекалии нимф начнут покрывать пол BHI, переложите в новую колбу BHI, добавив стерилизованный крысиный чау за 24 часа вперед (для проверки стерильности), как на шаге 5.1. 6. Контроль качества стерильности Удалите одну нимфу из колбы BHI, чтобы пожертвовать для независимой от культуры проверки качества гнотобиотического статуса с помощью полиморфизма длины фрагмента (RFLP). Для этого налейте нимфу в стерильную центрифужную трубку (аналогично нимфальному переносу со ступени 5.1) или поместите стерильный деревянный аппликатор в колбу и подождите, пока нимфа начнет подниматься по ней, затем перенесите ее в трубку центрифуги. Добавьте 0,5 мл 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) к нимфе в трубке центрифуги и гомогенизируйте стерильным микропестом до тех пор, пока все крупные куски не будут разбиты. Вихрь колодец. Извлеките ДНК из гомогената нимфы с помощью набора для экстракции бактериальной ДНК(Таблица материалов)следующим образом. Центрифугируют гомогенизированную нимфу в течение 10 мин при 5000 х г и удаляют надводный. Разогреть термошейкер до 37 °C. Добавьте 100 мкл 1x Tris-EDTA и вихрь, чтобы полностью повторно суспендировать гранулу. Добавьте 10 мкл лизоцима и перемешайте, после чего в 30 мин (без встряхивания) инкубация в предварительно нагретой термической шейкере с температурой 37 °C. Добавьте 25 мг стеклянных шариков в образцы и вихрь на максимальной скорости в течение 5 мин. Разогреть термошейкер до 55 °C. Дайте шарикам осесть перед переносом супернатанта в новую центрифужную трубку объемом 1,5 мл со 100 мкл буфера протеиназы К и 20 мкл протеиназы K. Vortex тщательно перемешать. Инкубировать, с встряхиванием при 600 об/мин, в термовстряхе 55 °C в течение 60 мин. Центрифуга при 10 000 х г в течение 2 мин и перенос супернатанта в новую центрифужную трубку 1,5 мл. Разогреть термошейкер до 65 °C. Начните предварительный нагрев буфера элюирования в гибридизационной печи с 65 °C. Добавьте 220 мкл 100% этанола. Вихрь на максимальной скорости в течение 20 с. Разбейте любой видимый осадок, пипетируя вверх и вниз 10x. Вставьте столбец ДНК в пробирку для сбора 2 мл и перенесите образец в столбец, включая любой осадок, который мог образоваться. Центрифуга при 10 000 х г в течение 1 мин, выбросьте фильтрат из коллекторной трубки и замените трубку для сбора. Добавьте 500 мкл связующего буфера в колонку и центрифугу при 10 000 х г в течение 1 мин. Выбросьте фильтрат из коллекционной трубки и замените коллекционную трубку. Добавьте 700 мкл буфера промывки ДНК в колонку и центрифугу при 10 000 х г в течение 1 мин. Выбросьте фильтрат из коллекционной трубки и замените коллекционную трубку. Повторите второй шаг стирки. Центрифуга пустая колонна в течение 2 мин сушит ее, после чего переносит колонну в новую центрифужную трубку объемом 1,5 мл. Добавьте 50 мкл предварительно нагретого элюированного буфера непосредственно в матрицу колонки ДНК и инкубируют при 65 °C в течение 5 мин. Центрифуга при 10 000 х г в течение 1 мин до элюции. Количественное получение извлеченной ДНК в фильтрате с помощью спектрофотометрии или флюорометрии. Ампулируют и переваривают весь ген 16S. Визуализируйте фрагменты с помощью гелевого электрофореза. Используйте 12,5 мкл 2x мастер-микса, 0,5 мкл каждого праймера 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT) и 27F (5′-AGAGTTTGATCCCCTGGCTCAG), 5 нг ДНК и молекулярную воду для общего объема реакции 25 мкл. Запустите следующую программу термоциклера: 94 °C в течение 60 с; затем 35 циклов с 94 °C в течение 30 с, 50 °C в течение 45 с, 68 °C в течение 90 с; затем 68 °C в течение 5 мин. Очистите продукт полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью набора для очистки ДНК(Таблица материалов). Добавьте 120 мкл очищающего буфера к продукту ПЦР и вихрь для смешивания. Кратковременно центрифугировать для сбора капель внутри крышки. Вставить колонку ДНК в трубку для сбора 2 мл, перенести жидкость в подготовленную колонку и центрифугу при ≥13 000 х г в течение 1 мин. Выбросьте фильтрат и замените коллекторную трубку. Добавьте 700 мкл буфера для промывки ДНК и центрифуги при ≥13 000 х г в течение 1 мин. Выбросьте фильтрат и замените коллекторную трубку. Повторите второй шаг стирки. Центрифугируют пустую колонну в течение 2 мин для высыхания и переносят колонну в новую центрифужную трубку объемом 1,5 мл. Добавьте 50 мкл предварительно нагретого элюидного буфера непосредственно в матрицу колонки ДНК и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 мин. Центрифуга при 10 000 х г в течение 1 мин до элюции. Количественное получение извлеченной ДНК в фильтрате с помощью спектрофотометрии или флюорометрии. Добавьте 1 мкг очищенного продукта ПЦР к 5 мкл буфера пищеварения, 10 единиц RsaI и молекулярной воды для общего объема реакции 50 мкл. Смешайте путем пипетирования вверх и вниз и инкубировать при 37 °C в течение 60 мин. Отделите переваренный продукт с помощью гелевого электрофореза, запустив 20 мкл перевареной ДНК на 2% агарозном геле. Визуализируйте гель для подтверждения гнотобиотического статуса.ПРИМЕЧАНИЕ: Гнотобиотические насекомые должны приводить только к полосам при 402 bp, 201 bp и мазке от 163 до 148 bp, основываясь на последовательности 16S рДНК эндозимбионта, Blattabacterium. Любые дополнительные полосы, видимые в геле, указывают на загрязняющие микробные виды. 7. Асептическое отслеживание роста нимфы Запишите длину тела, чтобы отслеживать рост нимфы, измеряя насекомых через полупрозрачный пол BHI колбы.ПРИМЕЧАНИЕ: Нимфы могут быть помещены при 4 °C в течение 15 минут, чтобы замедлить их движение, тем самым облегчая их измерение.

Representative Results

Резервуары для запасов настроены так, как показано на рисунке 1. «Беременные» самки идентифицируются по оотеке, прикрепленной к заднему брюшку, как показано на рисунке 2. Инкубация оотека на агаре BHI позволяет контролировать качество гнотобиотиков неразрушающим образом. В некоторых случаях стерилизация оказывается неудачной, и рост появляется вокруг оотеков, как показано на рисунке 3B. Эти оотеки должны быть удалены и выброшены. В наших руках наблюдался 10% средний процент отказов для стерилизации (n = 51). Оотеки вылупляются в среднем через 34 дня после стерилизации без роста на среде, как показано на рисунке 3А. Мы наблюдали типичную скорость вылупления 41% (n = 46) для стерилизованных, незагрязненных оотеков, в среднем 11 нимф на оотеку. Более крупные нимфы переносятся в колбы BHI, покрытые фольгой, как показано на рисунке 4. Фольга предотвращает загрязнение, и нимфам есть место для роста. RFLP 16S рДНК от гомогенизированной нимфы используется для подтверждения гнотобиотического статуса. Было замечено, что гнотобиотические нимфы растут более медленными темпами, чем их нестерильные коллеги, как показано на рисунке 5. На рисунке 6 показаны результаты успешно гнотобиотических насекомых, а также стандартных (нестерильных) нимф. Хотя этот тест еще не выявил загрязнения в отсутствие положительного результата культивирования, этот шаг регулярно проводился во время критических экспериментов, чтобы исключить присутствие загрязняющих кислород чувствительных или привередливых микробов. Более медленный рост наблюдался у гнотобиотических тараканов по сравнению со стандартными / нестерильными насекомыми. Рисунок 1: Настройка культуры стай тараканов.Картонные трубки можно увидеть сложенными в дальнем конце резервуара. Еда и вода находятся рядом с передней частью резервуара. Крышка из хлопчатобумажной ткани и резинка были сняты для видимости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: «Беременный» американский таракан.Стрелка указывает на оотеку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Изображения успешно гнотобиотических нимф, вылупившихся и неудачно стерилизовавших оотеки на наклонах BHI.Oothecae стерилизовали и инкубировали, как описано в этом протоколе. (A)Отсутствие микробного роста на наклоне BHI указывает на то, что насекомые свободны от культивируемых организмов. (B) Oothecae на наклонах, которые приводят к образованию колоний, должны быть выброшены как загрязненные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Гнотобиотический аппарат для выращивания.Насекомых держат в стерильных колбах, покрытых фольгированной крышкой для предотвращения загрязнения. Вторичный контейнер (зеленая крышка) стерилизуется 2% отбеливателем, а затем 70% этанолом. Поток воздуха во вторичном контейнере не ограничен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Репрезентативные данные о темпах роста, сравнивающие длину тела гнотобиотических и нестерильных нимф. Обе группы насекомых питались диетой автоклавных грызунов. Гнотобиотические насекомые (здесь: n = 105) содержатся на BHI, как описано. Нестерильные насекомые (здесь: n = 50) живут в колбах с автоклавной подстилкой из щепы с небольшими посудами для воды. Нестерильные нимфы растут со средней скоростью 0,059 мм / день, в то время как гнотобиотические нимфы растут со скоростью 0,028 мм / день (p < 0,0001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 6: Репрезентативное гелевое изображение результатов RFLP для контроля качества.Ампликоны гена Whole-16S переваривались с помощью RsaI. ДНК для ПЦР была извлечена из нимф, гомогенизированных в 1x PBS. Полосы «G nymph» соответствуют гнотобиотическим нимфам, в то время как полосы «conv nymph» соответствуют обычным, нестерильным аналогам. Основываясь на виртуальном рестриктующем дайджесте, эндозимбионт(Blattabacterium),как ожидается, будет иметь полосы размерами 402 bp, 206 bp и 163 bp, с мазком полос между 163 bp и 148 bp. Гнотобиотическое насекомое должно показывать только полосчатый рисунок Blattabacterium. Ожидается, что смешанное бактериальное сообщество будет иметь мазок из полос с различными размерами, помеченных здесь как «другие бактериальные фрагменты 16S». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Другие методы, описывающие генерацию гнотобиотических тараканов, либо не описывали коллекцию оотеков, либо использовали критерии, специфичные для других видов тараканов, чтобы указать, когда оотеки могут быть удалены из матери23,25,26. Первоначально оотеки собирались из подстилки из древесной щепа в резервуарах для запасов, что приводило к очень низкой скорости вылупления (~ 10%) по сравнению с нестерилизованными оотеками (47%)29. Вероятно, это связано с тем, что невыхлопнутые оотеки накапливаются с течением времени в клетке для стая, и нет никакого способа проверить возраст или жизнеспособность оотеки. Реализация подхода «родильного отделения» позволяет осуществлять сбор свежедепонированных яйцеклеток известного возраста. Это еще больше облегчает экспериментальное планирование, поскольку исследователь может предвидеть вероятное время вылупления для отдельных оотеков. Другая модификация из первоначальных и опубликованных протоколов включает инкубацию оотеков и нимф в полузапечатанные камеры, также содержащие перенасыщенный раствор хлорида натрия. Наличие раствора поддерживает относительную влажность воздуха примерно 75%30. Oothecae обычно инкубируют при 30 °C, что, как было показано, сводит к минимуму количество дней, необходимых для инкубации, а также максимизирует жизнеспособность эмбрионов и количество нимф, полученных на ootheca31. После вылупления гнотобиотические нимфы обычно культивируются на столешнице при температуре в лаборатории и условиях окружающей среды, хотя камеры с контролируемой влажностью снова используются для критических экспериментов. После установления этих изменений в сборе и инкубации оотеки частота вылупления увеличилась примерно до 41% (n = 51), не включая оотеки, удаленные из-за загрязнения. Потенциальный путь к дальнейшей оптимизации скорости вывода может включать в себя продление времени между сбором оотеки и стерилизацией. Кутикула яйцеклетки не может быть полностью загорелой при первоначальном высвобождении32и, следовательно, может быть проницаемой для растворов, используемых во время стерилизации, в течение 24 ч после сброса.

Протокол стерилизации с использованием 0,1% перуксусной кислоты был адаптирован из Doll et al.25. В других исследованиях были задокументированы альтернативные методы стерилизации oothecae23,26. Степень загрязнения основана на неразрушаемом методе инкубации оотека на уклоне BHI. Такой подход очень выгоден, так как позволяет быстро выявлять и удалять загрязненные оотеки. Большинство предыдущих протоколов проверяют культивируемые организмы путем покрытия фекалий или гомогенатов нимф на бактериологических средах и проверки роста22,23,25,27,28,33. По крайней мере, в одном случае метод тестирования гнотобиотического статуса не был полностью описан26. За исключением Клейтона, который добавил небольшую плиту теста стерильности среды к выращиванию бутылок24,предыдущие методы22,23 размещали гнотобиотических насекомых на бактериологических средах только в течение коротких периодов времени для первоначальной оценки протокола стерилизации.

Продолжение размещения полученных нимф на среде BHI в качестве встроенной меры контроля качества позволяет контролировать их гнотобиотический статус в полуреайт-тайме — метод, не замеченный в большинстве предыдущих методов22,23. Это особенно полезно для долгосрочных экспериментов, которые требуют доступа к гнотобиотическим нимфам. Если пол BHI под нимфами кажется загрязненным бактериальным или грибковым ростом, колбу следует выбросить. Этот тип загрязнения обычно возникает при раскрытии колб водным нимфам, но он также может возникнуть из фекалий в случае недостаточно стерилизованных оотеков или пищи. Использование ламинарной проточной вытяжки при поливе улучшает скорость загрязнения, вызванного вскрытием колбы.

Поскольку не все загрязняющие организмы могут аэробно расти на среде BHI, требуется дополнительный независимый от культуры метод тестирования стерильности. Одним из потенциальных подходов является микроскопия27,но этот подход может быть трудоемким. Другие протоколы используют методы, основанные на последовательностях, для обнаружения организмов, которые могут покинуть культуру14,23,27,28. Однако такие подходы часто являются дорогостоящими и трудными для интерпретации, поскольку на результаты высокопроизводительных подходов к секвенированию может легко повлиять низкоуровневое загрязнение реагентов34 и штрих-кодов35. Вместо этого был разработан новый подход, который использует ПЦР-амплификацию гена 16S рРНК в сочетании с полиморфизмом длины рестрикционного фрагмента для визуализации как эндосимбионта, так и любых загрязняющих симбионтов кишечника. Этот метод включает в себя внутренний контроль ПЦР, поскольку ген Blattabacterium16S был секвенирован, и его полосатый паттерн должен присутствовать как у гнотобиотических, так и у нестерильных насекомых. Поскольку паттерн рестрикции эндозимбионта может быть предсказан по последовательности36его генома, нет необходимости секвенировать ампликоны или фрагменты рестрикции, если только не требуется идентификация какого-либо загрязняющего вещества. Текущая версия этого протокола призывает к принесению нимфы в жертву для ПЦР / RFLP, но этот метод также может быть использован на фекалиях в качестве неразрушающей меры. Однако он не будет включать в себя встроенный контроль, так как кал не должен содержать много Blattabacterium.

Дополнительным легко модифицируемым, но критическим компонентом выращивания гнотобиотических животных является диета. Хотя агар BHI может служить временным источником пищи для насекомых, было обнаружено, что он приводит к значительному дефициту роста среди нимф при использовании в качестве единственного источника пищи в течение длительных периодов времени. В то время как различные диеты были опробованы, автоклавируемый крысиный чау рекомендуется в качестве обычной диеты для поддержания гнотобиотических насекомых. Диеты, специально не разработанные для стерилизации, часто было трудно сделать полностью стерильными, и было обнаружено, что многие стерильные или автоклавируемые диеты лабораторных животных демонстрируют быстрый рост грибков в нестерильных условиях. Эта тенденция к деградации в нестерильных условиях сделала их непригодными для использования в экспериментах, непосредственно сравнивающих гнотобиотических и нонгнотобиотических насекомых. Рекомендуемая диета позволяет использовать последовательную диету между гнотобиотическими и стандартными нимфами, облегчая сравнение характеристик, таких как темпы роста, между двумя группами.

Как другие наблюдали27,гнотобиотические нимфы растут медленнее, чем их нестерильные собратья. Сравнение длины тела гнотобиотических (n = 105) и нестерильных нимф (n = 50), которых кормили одной и той же автоклавной диетой грызунов и держали при комнатной температуре, показывает, что нестерильные нимфы вырастают в среднем 0,059 мм / день, в то время как гнотобиотические нимфы растут 0,028 мм / день (p < 0,0001)(рисунок 5). Было показано, что присутствие кишечной микробиоты у P. americana изменяет скорость метаболизма насекомых37,и считается, что кишечные сообщества в целом влияют на поглощение питательных веществ38,39. Эти причины подтверждают наблюдаемые различия в скорости роста гнотобиотических и нестерильных нимф.

Возможным ограничением этого метода является то, что гнотобиотические нимфы могут не достигать половой зрелости, так как самые старые стерильные когорты старше 10 месяцев и достигли только седьмой звезды (из 10; 11 – взрослая жизнь), как приближено к длине тела40. Эти самые старые когорты не находятся на диете автоклавных крыс, а вместо этого едят облученный крысиный чау, диету, которая содержит слишком много влаги, чтобы кормить нестерильные когорты без чрезмерного роста плесени. Было обнаружено, что нестерильные нимфы на нестерилизованного кормовом рационе для собак достигают совершеннолетия через 9−10 месяцев в лабораторных условиях (комнатная температура и влажность). Когортам гнотобиотических и нестерильных нимф на общих автоклавных крысиных чау в настоящее время менее 7 месяцев, нестерильные насекомые оцениваются как седьмые в звезде (в среднем: 16,7 мм), в то время как стерильные насекомые оцениваются как пятые в звезде (в среднем: 11,2 мм). В результате мы пока не можем проверить, могут ли наши гнотобиотические тараканы успешно размножаться. Однако, учитывая легкость, с которой новые гнотобиотические когорты могут быть созданы с использованием этого подхода, этот метод показывает большие перспективы даже при отсутствии доказанного размножения гнотобиотических насекомых.

В заключение, этот протокол предоставляет универсальный инструмент, который позволяет исследователям микробиома управлять своим собственным, недорогим гнотобиотическим «объектом», используя общие лабораторные материалы. Этот подход может быть использован для генерации гнотобиотических тараканов для экспериментов, изучающих роль микробиоты в формировании поведения хозяина, иммунитета, развития и стрессовыхреакций 21,26,27. Эти гнотобиотические насекомые также могут быть инокулированы синтетическими или ксенобиотическими сообществами и впоследствии использованы в качестве субъектов для исследований кишечного микробиома23,28. Кроме того, элементы этого подхода, включая использование бактериологических инкубационных камер с подкладкой из сред в качестве встроенной проверки стерильности, могут быть обобщены на другие модельные системы и могут облегчить рутинное содержание гнотобиотических животных в учреждениях меньшего масштаба.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта публикация была поддержана Национальным институтом общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под номером R35GM133789. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно представляет официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. Авторы хотели бы поблагодарить Джози Дайера за отслеживание скорости стерилизации, скорости вылупления и темпов роста гнотобиотических тараканов.

Materials

2X master mix New England BioLabs M0482 OneTaq MasterMix
Autoclavable rat chow Zeigler NIH-31 Modified Auto
Bacterial DNA extraction kit Omega Bio-Tek D-3350 E.Z.N.A. Bacterial DNA kit; includes lysozyme, glass beads, proteinase K, buffers (proteinase K, binding, wash, elution), DNA columns, 2-mL collection tube
binding buffer Omega Bio-Tek PD099 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("HBC" buffer)
brain-heart infusion (BHI) broth Research Products International B11000
Delicate task wipes KimWipe JS-KCC-34155-PK KimWipes
DNA purification kit Omega Bio-Tek D6492 E.Z.N.A. Cycle Pure kit; D6493 may also be used; includes buffers (purifying ,wash, elution)
elution buffer Omega Bio-Tek PDR048 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
glass beads Omega Bio-Tek n/a included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
Hybridization oven UVP 95-0330-01 we use a hybridization oven for preheating elution buffer, but a water bath could probably also be used
Laminar flow biological safety cabinet NuAire, Inc. NU-425-400 Protocol refers to this as "laminar flow hood" for brevity
lysozyme Omega Bio-Tek n/a included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
peracetic acid stock solution (32%) Sigma-Aldrich 269336
Petroleum jelly Vaseline n/a
proteinase K buffer Omega Bio-Tek PD061 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("TL buffer")
purifying buffer Omega Bio-Tek PDR042 included in Omega Biotek's CyclePure kit ("CP" buffer)
RsaI New England BioLabs R0167 Includes CutSmart (digestion) buffer
Secondary container n/a n/a a plastic container with a lid (such as a Kritter Keeper) works well for this (25cm long x 15cm wide x 22cm high); it should be large enough to fit BHI slants and test tubes
spectrophotometer ThermoFisher ND-2000 Catalog info is for NanoDrop2000
thermal shaker Eppendorf EP5386000028 Thermomixer R
Tris-EDTA Fisher BP1338-1 10 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8
wash buffer Omega Bio-Tek PDR044 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("DNA wash" buffer)
Woodchip bedding P.J. Murphy Forest Products Sani-Chips
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yi, P., Li, L. The germfree murine animal: An important animal model for research on the relationship between gut microbiota and the host. Veterinary Microbiology. 157 (1-2), 1-7 (2012).
  2. Nature Biotechnology. Laying better plans for mice. Nature Biotechnology. 31 (4), 263-263 (2013).
  3. Nicklas, W., Keubler, L., Bleich, A. Maintaining and Monitoring the Defined Microbiota Status of Gnotobiotic Rodents. ILAR Journal. 56 (2), 241-249 (2015).
  4. Faith, J. J., Ahern, P. P., Ridaura, V. K., Cheng, J., Gordon, J. I. Identifying Gut Microbe-Host Phenotype Relationships Using Combinatorial Communities in Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 6 (220), 11 (2014).
  5. Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
  6. Eun, C. S., et al. Induction of Bacterial Antigen-Specific Colitis by a Simplified Human Microbiota Consortium in Gnotobiotic Interleukin-10-/- Mice. Infection and Immunity. 82 (6), 2239-2246 (2014).
  7. Cherbuy, C., et al. Microbiota matures colonic epithelium through a coordinated induction of cell cycle-related proteins in gnotobiotic rat. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (2), 348-357 (2010).
  8. Van Den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans and inulin differentially modulate the mucosal and luminal gut microbiota and mucin-degradation in humanized rats. Environmental Microbiology. 13 (10), 2667-2680 (2011).
  9. Stecher, B., Berry, D., Loy, A. Colonization resistance and microbial ecophysiology: using gnotobiotic mouse models and single-cell technology to explore the intestinal jungle. FEMS Microbiology Reviews. 37 (5), 793-829 (2013).
  10. Sugahara, H., et al. Probiotic Bifidobacterium longum alters gut luminal metabolism through modification of the gut microbial community. Scientific Reports. 5 (1), 13548 (2015).
  11. Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 409 (2016).
  12. Mallapaty, S. Gnotobiotics: getting a grip on the microbiome boom. Lab Animal. 46 (10), 373-377 (2017).
  13. Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
  14. Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development. Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).
  15. Trinder, M., Daisley, B. A., Dube, J. S., Reid, G. Drosophila melanogaster as a High-Throughput Model for Host–Microbiota Interactions. Frontiers in Microbiology. 8, 751 (2017).
  16. Zheng, H., Steele, M. I., Leonard, S. P., Motta, E. V. S., Moran, N. A. Honey bees as models for gut microbiota research. Lab animal. 47 (11), 317-325 (2018).
  17. Engel, P., Moran, N. A. The gut microbiota of insects – diversity in structure and function. FeMS Microbiology Reviews. 37 (5), 699-735 (2013).
  18. Tinker, K. A., Ottesen, E. A. The Core Gut Microbiome of the American Cockroach, Periplaneta americana, Is Stable and Resilient to Dietary Shifts. Applied and Environmental Microbiology. 82 (22), 6603-6610 (2016).
  19. Zurek, L., Keddie, B. A. Contribution of the colon and colonic bacterial flora to metabolism and development of the american cockroach Periplaneta americana L. Journal of Insect Physiology. 42 (8), 743-748 (1996).
  20. Cruden, D. L., Markovetz, A. J. Microbial aspects of the cockroach hindgut. Archives of Microbiology. 138, 131-139 (1984).
  21. Pietri, J. E., Tiffany, C., Liang, D. Disruption of the microbiota affects physiological and evolutionary aspects of insecticide resistance in the German cockroach, an important urban pest. PLoS ONE. 13 (12), 0207985 (2018).
  22. Benschoter, C., Wrenn, R. Germfree techniques for establishment and maintenance of a colony of aseptic German cockroaches. Annals of the Entomological Society of America. 65 (3), 641-644 (1972).
  23. Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen Affects Gut Bacterial Colonization and Metabolic Activities in a Gnotobiotic Cockroach Model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
  24. Clayton, R. A simplified method for the culture of Blattella germanica under aseptic conditions. Nature. 184 (4693), 1166-1167 (1959).
  25. Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The Use of Peracetic Acid to Obtain Germfree Invertebrate Eggs for Gnotobiotic Studies. American Midland Naturalist. 69 (1), 231 (1963).
  26. Wada-Katsumata, A., et al. Gut bacteria mediate aggregation in the German cockroach. Proceedings of the National Academy of Science. 112, 15678-15683 (2015).
  27. Jahnes, B. C., Herrmann, M., Sabree, Z. L. Conspecific coprophagy stimulates normal development in a germ-free model invertebrate. PeerJ. 7, 6914 (2019).
  28. Mikaelyan, A., Thompson, C. L., Hofer, M. J., Brune, A. Deterministic Assembly of Complex Bacterial Communities in Guts of Germ-Free Cockroaches. Applied Environmental Microbiology. 82 (4), 1256-1263 (2016).
  29. Katoh, K., et al. Group-housed females promote production of asexual ootheca in American cockroaches. Zoological Letters. 3, 3 (2017).
  30. Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81 (1), 89-96 (1976).
  31. Bressan-Nascimento, S., Oliveira, D. M. P., Fox, E. G. P. Thermal requirements for the embryonic development of Periplaneta americana (L.) (Dictyoptera: Blattidae) with potential application in mass-rearing of egg parasitoids. Biological Control. 47 (3), 268-272 (2008).
  32. Nation, J. L. . Insect Physiology and Biochemistry, Second Edition. , (2008).
  33. House, H. L. Nutritional studies with Blattella germanica (L.) reared under aseptic conditions I. Equipment and technique. The Canadian Entomologist. 81 (5), 94-100 (1949).
  34. Stinson, L. F., Keelan, J. A., Payne, M. S. Identification and removal of contaminating microbial DNA from PCR reagents: impact on low-biomass microbiome analyses. Letters in Applied Microbiology. 68 (1), 2-8 (2018).
  35. Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform. Nucleic Acids Research. 40, 3 (2011).
  36. Sabree, Z. L., Kambhampati, S., Moran, N. A. Nitrogen recycling and nutritional provisioning by Blattabacterium, the cockroach endosymbiont. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 106 (46), 19521-19526 (2009).
  37. Ayayee, P. A., Ondrejech, A., Keeney, G., Muñoz-Garcia, A. The role of gut microbiota in the regulation of standard metabolic rate in female Periplaneta americana. PeerJ. 6, 4717 (2018).
  38. Krajmalnik-Brown, R., Ilhan, Z. E., Kang, D. W., DiBaise, J. K. Effects of gut microbes on nutrient absorption and energy regulation. Nutrition in clinical practice : official publication of the American Society for Parenteral and Enteral Nutrition. 27 (2), 201-214 (2012).
  39. Rowland, I., et al. Gut microbiota functions: metabolism of nutrients and other food components. European Journal of Nutrition. 57 (1), 1-24 (2018).
  40. Gier, H. T. Growth rate in the cockroach Periplaneta americana (Linn). Annals of the Entomological Society of America. 40, 303-317 (1947).

Tags

Artificial IntelligenceAI Writing AssistantsCopywritingContent GenerationText ProductionContent CreationAI-assisted WritingAI CopywritersAI-powered Writing Tools

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Dukes, H. E., Dyer, J. E., Ottesen, E. A. Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana). J. Vis. Exp. (171), e61316, doi:10.3791/61316 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image