إنشاء وصيانة الصراصير الأمريكية الغنوتوبيوتية (Periplaneta americana)
Summary
يستخدم هذا البروتوكول في إنشاء وصيانة الصراصير الأمريكية الغنوتوبيوتية(Periplaneta americana)عن طريق تعقيم حالات البيض (oothecae) قبل الفقس. تحتوي هذه الحشرات الغنوبية على بطانات البلاتاباكتيريا المنقولة رأسيا ولكن لديها أحشاء محورية.
Abstract
الحيوانات الغنوتوبيوتية هي أداة قوية لدراسة الضوابط على بنية الميكروبيوم ووظيفته. هنا هو بروتوكول لإنشاء وصيانة الصراصير الأمريكية الغنوتوبيوتك(Periplaneta أمريكانا). ويشمل هذا النهج عمليات فحص العقم المدمجة للتحقق من الجودة المستمرة. تعرف الحشرات الغنوتوبيوتية هنا بأنها صراصير لا تزال تحتوي على إندوسيمبيونت المنقول رأسيا(Blattabacterium)ولكنها تفتقر إلى الميكروبات الأخرى التي تتواجد عادة على سطحها وفي الجهاز الهضمي. لهذا البروتوكول، تتم إزالة حالات البيض (oothecae) من مستعمرة الأسهم (غيرsterile) وتعقيم السطح. وبمجرد جمعها وتعقيمها، يتم احتضان الأوثيكاي عند 30 درجة مئوية لمدة 4-6 أسابيع تقريبا على أجار ضخ الدماغ والقلب (BHI) حتى يفقس أو تتم إزالته بسبب التلوث. يتم نقل الحوريات المفقسة إلى قارورة Erlenmeyer تحتوي على أرضية BHI ومياه معقمة وطعام فئران معقم. لضمان أن الحوريات ليست الميكروبات السكنية التي لا تستطيع أن تنمو على BHI في ظروف معينة، يستخدم تدبير إضافي لمراقبة الجودة تقييد تعدد الأشكال طول جزء (RFLP) لاختبار الميكروبات غير التكافلية. يمكن تلقيح الحوريات الغنوتوبيوتية المتولدة باستخدام هذا النهج مع المجتمعات الميكروبية البسيطة أو المعقدة واستخدامها كأداة في دراسات ميكروبيوم الأمعاء.
Introduction
وقد أثبتت الحيوانات الغنوتوبيوتية لتكون أدوات لا تقدر بثمنلدراساتالميكروبيوم 1،2،3. سمحت الحيوانات الخالية من الجراثيم والمحددة النباتات باختزال التفاعلات بين المضيف والميكروب ، بما في ذلك الاستجابات المناعية المضيفة ، ونضوج ظهارة الأمعاء ، والتمثيل الغذائي المضيف1و4و5و6و7. وقد ساعدت الحيوانات الغنوتوبيوتية تلقيح مع مجتمع مبسط أيضا في فهم أكثر اكتمالا للتفاعلات الميكروبات والميكروبات في المجتمع الأمعاء، وتحديدا في كشف عبر التغذية والعلاقات العدائية8،9،10،11. النظام النموذجي المفضل الحالي للدراسات في ميكروبيوم الأمعاء الثديية هو نموذج المورين. وفي حين أن هذا النظام كان حيويا في الاكتشافات المبينة أعلاه، فإن أحد أوجه القصور الرئيسية هو التكلفة التي ينطوي عليها الأمر. 10 – ومن الضروري توفير معدات متخصصة وفنيين مدربين تدريبا عاليا لإنشاء مرفق للكائنات الحية والاحتفاظ به. هذا، في تركيبة مع الرعاية الإضافية التي يجب أن تعطى لكل جانب من جوانب الحفاظ على الحيوانات الغنوتوبيوتك، يسبب الغنوتوبيوتك لتكلفة عشر إلى عشرين مرة أكثر من تربية نموذج حيواني قياسي12. بسبب ارتفاع التكاليف، قد يكون العديد من الباحثين غير قادرين على تحمل نموذج مورين الغنوتوبيوتك. بالإضافة إلى ذلك، في حين أن نماذج مورين قد يكون الخيار الأكثر قبولا على نطاق واسع للدراسات التي تتطلع إلى ترجمة إلى صحة الإنسان، لا تزال هناك العديد من الاختلافات الفسيولوجية والمورفولوجية بين أحشاء الإنسان والفأر13. من الواضح أنه لا يوجد نموذج فريد يكفي للإجابة على العدد المتزايد من الأسئلة المتعلقة بالجوانب العديدة لميكروبيوم الأمعاء.
نماذج الحشرات هي بديل أرخص بسبب انخفاض تكلفة الصيانة بالمقارنة مع أنواع الثدييات. وقد أدت البحوث الواسعة النطاق الخالية من الجراثيم والكائنات الحية في مجموعة متنوعة من أنواع الحشرات إلى تطوير نماذج متعددة شائعة الاستخدام. البعوض و Drosophila هي نماذج شائعة للعمل الخالي من الجراثيم نظرا لأهميتها للأمراض العالمية وقابلية المسالك الوراثية14،15. نظام نموذج آخر الناشئة هو أن نحلة العسل(Apis mellifera)، نظرا لاهميتها في التلقيح والبحوث الاجتماعية16. ومع ذلك ، فإن العديد من هذه الحشرات شائعة الاستخدام تفتقر إلى التعقيد التصنيفي الذي شوهد في مجتمعات الأمعاء الثديية17، مما يحد من قدرتها على نمذجة التفاعلات ذات الترتيب الأعلى. ليس فقط التنوع الكلي للميكروبات الموجودة في أمعاء الصراصير الأمريكية أكثر تشابها مع الثدييات ، ولكن العديد من الميكروبات الموجودة في القناة الهضمية للصرصور تنتمي إلى العائلات والفيرلا التي توجد عادة في ميكروبيوتا الأمعاء من الثدييات والبشر18. كما أن الحشرة الخلفية للصرصور مماثلة وظيفيا للأمعاء الغليظة للثدييات ، لأنها غرفة تخمير مكتظة بالبكتيريا للمساعدة في استخراج العناصر الغذائية19،20. وأخيرا ، فإن الطبيعة الشاملة للصراصير تسمح بتنوع أنظمة النظام الغذائي التي لن تكون ممكنة مع المتخصصين في النظام الغذائي.
الصراصير الأمريكية يمكن أن تكون نظاما نموذجيا مفيدا لفهم المجتمعات الميكروبية في الأمعاء في الكائنات الحية العليا ، ولكن وضع الصرصور كآفة يجعل هذا النظام مناسبا لمكافحة الآفات21. تساعد الاستفادة من المعرفة الأساسية لتأثير مجتمع الأمعاء على صحة الصرصور وعلم وظائف الأعضاء في تطوير تقنيات جديدة لإدارة الآفات.
الهدف من هذه الطريقة هو تحديد وصف شامل لإنشاء وصيانة الصراصير الأمريكية الغنوتوبيوتية(Periplaneta americana)، ولكن يمكن استخدام هذا البروتوكول لتوليد حوريات أي صرصور أوفيباروس. وهو يتضمن طريقة لجمع فعالة وغير الباضعة من oothecae ناضجة ، وتقنية غير تدميرية لرصد الحالة الغنوتوبيوتية للحشرات22،23،24. في حين أن الطرق السابقة لتحقيق وصيانة الصراصير الغنوتوبيوتك تصف جمع ootheca23،24،25،26،27، يتم تفسير نضج ootheca إما من حيث الإشارات الخاصة بالأنواع (في Blattella germanica22،24،25)، أو لم يتم وصفها صراحة27،28، مما يجعل التنفيذ صعبا على أولئك غير المألوفين مع النظام. منذ الطريقة الموصوفة هنا يستخدم oothecae انخفض بشكل طبيعي، خطأ إزالة البيض قبل الأوان غائبة. يحتوي هذا البروتوكول على أساليب تعتمد على الثقافة ومستقلة عن الثقافة لمراقبة الجودة ، ولا تتطلب الطريقة المعتمدة على الثقافة التضحية بالحشرات. وأخيرا ، تجمع هذه الطريقة معلومات من دراسات صرصور غنوتبيوتك متعددة لإنشاء بروتوكول شامل واحد مع جميع المعلومات اللازمة لتحقيق الصراصير الغنوتوبيوتية والحفاظ عليها.
Protocol
Representative Results
Discussion
طرق أخرى تصف جيل الصراصير الغنوتوبيوتك إما لم تصف جمع oothecae أو استخدمت معايير خاصة بأنواع الصراصير الأخرى للإشارة إلى متى يمكن إزالة oothecae من الأم23و25و26. في الأصل، تم جمع oothecae من الفراش الخشب في خزانات الأسهم، مما أدى إلى معدلات فتحة منخفضة جدا (~ 10٪) مقارنة مع oothecae غير المسترة (47٪)29. هذا هو المرجح يرجع ذلك إلى حقيقة أن oothecae غير المفقس تتراكم مع مرور الوقت في قفص الأسهم، وليس هناك طريقة للتحقق من العمر ootheca أو الجدوى. ويتيح تنفيذ نهج “جناح الأمومة” جمع الأوثيكاي المودع حديثا في سن معروفة. وهذا يسهل التخطيط التجريبي، حيث يمكن للباحث توقع أوقات الفقس المحتملة لoothecae الفردية. ومن التعديلات الأخرى التي أدخلت على البروتوكولات الأولية والمنشرة احتضان الأوثيكاي والحوريات في غرف شبه مغلقة تحتوي أيضا على محلول كلوريد الصوديوم فائق التشبع. وجود الحل يحافظ على رطوبة نسبية تبلغ حوالي 75٪30. يتم احتضان Oothecae بشكل روتيني عند 30 درجة مئوية ، والتي ثبت أنها تقلل من عدد الأيام المطلوبة للحضانة مع زيادة صلاحية الأجنة وعدد الحوريات المنتجة لكل ootheca31. بعد الفقس، يتم استزراع الحوريات الغنوتوبيوتية بشكل روتيني على سطح المقعد في درجة حرارة غرفة المختبر والظروف المحيطة، على الرغم من أن الغرف التي تسيطر عليها الرطوبة تستخدم مرة أخرى للتجارب الحرجة. بعد إنشاء هذه التغييرات لجمع ootheca واحتضانها ، زادت معدلات الفتحات إلى حوالي 41٪ (ن = 51) ، وليس بما في ذلك إزالة oothecae بسبب التلوث. قد يتضمن الطريق المحتمل لزيادة تحسين معدلات الفتحة تمديد الوقت بين جمع ootheca والتعقيم. قد لا يكون البشرة من حالة البيض المدبوغة تماما على الإصدار الأولي32، وبالتالي قد تكون نفاذية إلى الحلول المستخدمة أثناء التعقيم في غضون 24 ساعة من إسقاطها.
تم تكييف بروتوكول التعقيم باستخدام حمض البيراسيتيك 0.1٪ من الدميةوآخرون. وقد وثقت دراسات أخرى تقنيات بديلة لتعقيم oothecae23،26. وتستند معدلات التلوث على طريقة غير تدميرية لاحتضان oothecae على ميل BHI. هذا النهج مفيد للغاية لأنه يسمح بالتعرف السريع على oothecae الملوث وإزالتها. معظم البروتوكولات السابقة اختبار للكائنات القابلة للترسيح عن طريق طلاء البراز أو الحورية متجانسة على وسائل الإعلام البكتريولوجية والتحقق من النمو22،23،25،27،28،33. في حالة واحدة على الأقل، لم يتم وصف طريقة اختبار الحالة الغنوتوبيوتية بشكل كامل26. باستثناء كلايتون الذي أضاف لوح صغير من العقم اختبار المتوسطة لتربية زجاجات24، الأساليب السابقة22،23 يضم الحشرات الغنوتوبيوتك على وسائل الإعلام البكتريولوجية فقط لفترات قصيرة من الزمن لتقييم بروتوكول التعقيم في البداية.
استمرار إسكان الحوريات الناتجة على المتوسط BHI كإجراء مدمج لمراقبة الجودة يسمح بمراقبة حالتها الغنوتوبيوتية في الوقت شبه الحقيقي – وهي تقنية لم تشاهد في معظم الطرق السابقة22،23. وهذا مفيد بشكل خاص للتجارب طويلة الأجل التي تتطلب الحوريات الغنوتوبيوتية للوصول إليها. إذا كانت أرضية BHI تحت الحوريات تبدو ملوثة بالنمو البكتيري أو الفطري ، فيجب التخلص من القارورة. يحدث هذا النوع من التلوث عادة عند الكشف عن القوارير إلى حوريات الماء ، ولكنه قد ينشأ أيضا من البراز في حالة oothecae أو الطعام المعقم بشكل غير كاف. استخدام غطاء محرك السيارة تدفق صفح عند سقي يحسن معدل التلوث الناجم عن الكشف عن القوارير.
وبما أن الكائنات الحية الملوثة قد تنمو بشكل هوائي على متوسط BHI ، فإن هناك حاجة إلى طريقة إضافية مستقلة عن الثقافة لاختبار العقم. أحد النهج المحتملة هو المجهر27، ولكن هذا النهج يمكن أن يكون كثيف العمالة. تستخدم بروتوكولات أخرى تقنيات قائمة على التسلسل للكشف عن الكائنات الحية التي قد تفلت من الثقافة14و23و27و28. ومع ذلك ، فإن مثل هذه النهج غالبا ما تكون مكلفة ويصعب تفسيرها ، حيث يمكن بسهولة أن تتأثر نتائج نهج التسلسل عالي الإنتاجية بالتلوث المنخفض المستوى للكواشف34 والباركود الذي يقفز35. بدلا من ذلك، تم تطوير نهج جديد يستخدم تضخيم PCR من الجين rRNA 16S في تركيبة مع تقييد تعدد الأشكال طول جزء لتصور كل من الإندوسيمبيونت وأي symbionts الأمعاء الملوثة. تتضمن هذه التقنية مكافحة PCR داخلية ، حيث تم تسلسل جين Blattabacterium‘s 16S ، ويجب أن يكون نمط النطاقات موجودا في كل من الحشرات الغنوتوبيوتية وغير النجمية. كما يمكن التنبؤ نمط تقييد endosymbiont من تسلسل الجينوم36، ليست هناك حاجة لتسلسل amplicons أو شظايا تقييد ، ما لم يكن من المرغوب تحديد أي ملوث. وتدعو النسخة الحالية من هذا البروتوكول إلى التضحية بالحورية من أجل PCR/RFLP، ولكن يمكن أيضا استخدام هذه التقنية على البراز كإجراء غير تدميري. ومع ذلك ، فإنه لن يتضمن التحكم المدمج ، حيث لا ينبغي أن يحتوي البراز على الكثير من Blattabacterium.
عنصر إضافي قابل للتعديل بسهولة ولكن حاسمة من تربية الحيوانات الغنوتوبيوتية هو النظام الغذائي. في حين أن BHI agar يمكن أن يكون بمثابة مصدر غذائي مؤقت للحشرات ، فقد وجد أنه يؤدي إلى عجز كبير في النمو بين الحوريات عند استخدامها كمصدر غذائي وحيد لفترات طويلة. في حين تم تجربة الوجبات الغذائية المتنوعة ، يوصى بتناول طعام الفئران القابل للرقم التلقائي كحمية روتينية للحفاظ على الحشرات الغنوتوبيوتك. وكثيرا ما كان من الصعب جعل الوجبات الغذائية غير المعدة خصيصا للتعقيم معقمة تماما، ووجد أن العديد من الوجبات الغذائية الحيوانية المختبرية العقيمة أو القابلة للاغتباد تظهر نموا فطريا سريعا في ظل ظروف غير استرile. هذا الميل إلى التحلل في ظل ظروف غير نجمية جعلها غير مناسبة للاستخدام في التجارب التي تقارن مباشرة الحشرات الغنوتوبيوتية وغير الكائنات الحية. النظام الغذائي الموصى به يسمح باستخدام نظام غذائي ثابت بين الحوريات الغنوتوبيوتية والحوريات القياسية ، مما يسهل مقارنة الخصائص – مثل معدلات النمو – بين المجموعتين.
كما لاحظ آخرون27، تنمو الحوريات الغنوتوبيوتية ببطء أكثر من نظيراتها غير النجمية. مقارنة بين أطوال الجسم من الكائنات الحية الغنوبية (ن = 105) والحوريات غيرsterile (ن = 50) تغذية نفسه، نظام غذائي القوارض autoclaved وأبقى في درجة حرارة الغرفة يكشف أن الحوريات غيرsterile تنمو في المتوسط 0.059 ملم / يوم، في حين تنمو الحوريات الغنوتوبيوتك 0.028 ملم / يوم (ص < 0.0001) (الشكل 5). وقد ثبت وجود ميكروبيوتا الأمعاء في P. أمريكانا لتغيير معدل الأيض الحشرات37, ويعتقد أن المجتمعات الأمعاء بشكل عام تؤثر على امتصاص المواد الغذائية38,39. تدعم هذه الأسباب الاختلافات الملحوظة في معدل نمو الحوريات الغنوتوبيوتية وغير النجمية.
وهناك قيود محتملة على هذه التقنية هو أن الحوريات الغنوتوبيوتية قد لا تصل إلى مرحلة النضج الجنسي ، حيث أن أقدم الأفواج العقيمة عمرها أكثر من 10 أشهر ووصلت فقط إلى النجم السابع (من أصل 10 ؛ 11 يجري سن البلوغ) كما يقترب طول الجسم40. هذه الأفواج الأقدم ليست على النظام الغذائي الفئران autoclaved ولكن بدلا من ذلك أكل تشاو الفئران المشععة، وهو النظام الغذائي الذي يحتوي على الكثير من الرطوبة لإطعام الأفواج غيرsterile دون نمو العفن المفرط. تم العثور على حوريات غير نجمية على نظام غذائي غير معقم لطعام ال تصل إلى مرحلة البلوغ بعد 9-10 أشهر في ظل ظروف مختبرية (درجة حرارة الغرفة والرطوبة). أفواج من الحوريات الغنوتوبيوتية وغير النجمية على طعام الفئران المشتركة والمكلافة تلقائيا هي حاليا أقل من 7 أشهر من العمر ، ويقدر أن الحشرات غير النجمية هي النجم السابع (المتوسط: 16.7 مم) في حين تقدر الحشرات العقيمة لتكون النجم الخامس (المتوسط: 11.2 ملم). ونتيجة لذلك ، لا يمكننا ، حتى الآن ، التحقق مما إذا كانت الصراصير الغنوتوبيوتك لدينا يمكن أن تتكاثر بنجاح. ومع ذلك ، بالنظر إلى السهولة التي يمكن بها إنشاء أفواج غنوتوبيوتك جديدة باستخدام هذا النهج ، فإن هذه الطريقة تظهر وعدا كبيرا حتى في غياب التكاثر المؤكد للحشرات الغنوتوبيوتية.
في الختام، يوفر هذا البروتوكول أداة متعددة الاستخدامات تسمح للباحثين في الميكروبيوم بتشغيل “منشأة” غنوتوبيوتك منخفضة التكلفة خاصة بهم باستخدام مواد مختبرية شائعة. يمكن استخدام هذا النهج لتوليد الصراصير الغنوتوبيوتية للتجارب التي تدرس دور الكائنات الحية المجهرية في تشكيل سلوك المضيف والمناعة والتنمية والاستجابات الإجهاد21،26،27. قد يتم تلقيح هذه الحشرات الغنوتوبيوتية أيضا مع المجتمعات الاصطناعية أو الزينوبيوتية وتستخدم لاحقا كمواضيع لدراسات ميكروبيوم الأمعاء23،28. وعلاوة على ذلك، فإن عناصر هذا النهج، بما في ذلك استخدام غرف الحضانة المبطنة بالوسائط الجرثومية كفحص تعقيم مدمج، قابلة للتعميم على نظم نموذجية أخرى ويمكن أن تسهل الصيانة الروتينية للحيوانات الغنوتوبيوتية في مرافق أصغر حجما.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا المنشور المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة التابع للمعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة R35GM133789. المحتوى هو فقط مسؤولية المؤلفين ولا يمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. يود المؤلفون الاعتراف بجوزي داير لتتبع معدلات التعقيم ومعدلات الفقس ومعدلات نمو الصراصير الغنوتوبيوتك.
Materials
| 2X master mix | New England BioLabs | M0482 | OneTaq MasterMix |
| Autoclavable rat chow | Zeigler | NIH-31 Modified Auto | |
| Bacterial DNA extraction kit | Omega Bio-Tek | D-3350 | E.Z.N.A. Bacterial DNA kit; includes lysozyme, glass beads, proteinase K, buffers (proteinase K, binding, wash, elution), DNA columns, 2-mL collection tube |
| binding buffer | Omega Bio-Tek | PD099 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("HBC" buffer) |
| brain-heart infusion (BHI) broth | Research Products International | B11000 | |
| Delicate task wipes | KimWipe | JS-KCC-34155-PK | KimWipes |
| DNA purification kit | Omega Bio-Tek | D6492 | E.Z.N.A. Cycle Pure kit; D6493 may also be used; includes buffers (purifying ,wash, elution) |
| elution buffer | Omega Bio-Tek | PDR048 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
| glass beads | Omega Bio-Tek | n/a | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
| Hybridization oven | UVP | 95-0330-01 | we use a hybridization oven for preheating elution buffer, but a water bath could probably also be used |
| Laminar flow biological safety cabinet | NuAire, Inc. | NU-425-400 | Protocol refers to this as "laminar flow hood" for brevity |
| lysozyme | Omega Bio-Tek | n/a | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
| peracetic acid stock solution (32%) | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Petroleum jelly | Vaseline | n/a | |
| proteinase K buffer | Omega Bio-Tek | PD061 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("TL buffer") |
| purifying buffer | Omega Bio-Tek | PDR042 | included in Omega Biotek's CyclePure kit ("CP" buffer) |
| RsaI | New England BioLabs | R0167 | Includes CutSmart (digestion) buffer |
| Secondary container | n/a | n/a | a plastic container with a lid (such as a Kritter Keeper) works well for this (25cm long x 15cm wide x 22cm high); it should be large enough to fit BHI slants and test tubes |
| spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | Catalog info is for NanoDrop2000 |
| thermal shaker | Eppendorf | EP5386000028 | Thermomixer R |
| Tris-EDTA | Fisher | BP1338-1 | 10 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8 |
| wash buffer | Omega Bio-Tek | PDR044 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("DNA wash" buffer) |
| Woodchip bedding | P.J. Murphy Forest Products | Sani-Chips |
References
- Yi, P., Li, L. The germfree murine animal: An important animal model for research on the relationship between gut microbiota and the host. Veterinary Microbiology. 157 (1-2), 1-7 (2012).
- Nature Biotechnology. Laying better plans for mice. Nature Biotechnology. 31 (4), 263-263 (2013).
- Nicklas, W., Keubler, L., Bleich, A. Maintaining and Monitoring the Defined Microbiota Status of Gnotobiotic Rodents. ILAR Journal. 56 (2), 241-249 (2015).
- Faith, J. J., Ahern, P. P., Ridaura, V. K., Cheng, J., Gordon, J. I. Identifying Gut Microbe-Host Phenotype Relationships Using Combinatorial Communities in Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 6 (220), 11 (2014).
- Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
- Eun, C. S., et al. Induction of Bacterial Antigen-Specific Colitis by a Simplified Human Microbiota Consortium in Gnotobiotic Interleukin-10-/- Mice. Infection and Immunity. 82 (6), 2239-2246 (2014).
- Cherbuy, C., et al. Microbiota matures colonic epithelium through a coordinated induction of cell cycle-related proteins in gnotobiotic rat. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (2), 348-357 (2010).
- Van Den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans and inulin differentially modulate the mucosal and luminal gut microbiota and mucin-degradation in humanized rats. Environmental Microbiology. 13 (10), 2667-2680 (2011).
- Stecher, B., Berry, D., Loy, A. Colonization resistance and microbial ecophysiology: using gnotobiotic mouse models and single-cell technology to explore the intestinal jungle. FEMS Microbiology Reviews. 37 (5), 793-829 (2013).
- Sugahara, H., et al. Probiotic Bifidobacterium longum alters gut luminal metabolism through modification of the gut microbial community. Scientific Reports. 5 (1), 13548 (2015).
- Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 409 (2016).
- Mallapaty, S. Gnotobiotics: getting a grip on the microbiome boom. Lab Animal. 46 (10), 373-377 (2017).
- Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development. Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).
- Trinder, M., Daisley, B. A., Dube, J. S., Reid, G. Drosophila melanogaster as a High-Throughput Model for Host–Microbiota Interactions. Frontiers in Microbiology. 8, 751 (2017).
- Zheng, H., Steele, M. I., Leonard, S. P., Motta, E. V. S., Moran, N. A. Honey bees as models for gut microbiota research. Lab animal. 47 (11), 317-325 (2018).
- Engel, P., Moran, N. A. The gut microbiota of insects – diversity in structure and function. FeMS Microbiology Reviews. 37 (5), 699-735 (2013).
- Tinker, K. A., Ottesen, E. A. The Core Gut Microbiome of the American Cockroach, Periplaneta americana, Is Stable and Resilient to Dietary Shifts. Applied and Environmental Microbiology. 82 (22), 6603-6610 (2016).
- Zurek, L., Keddie, B. A. Contribution of the colon and colonic bacterial flora to metabolism and development of the american cockroach Periplaneta americana L. Journal of Insect Physiology. 42 (8), 743-748 (1996).
- Cruden, D. L., Markovetz, A. J. Microbial aspects of the cockroach hindgut. Archives of Microbiology. 138, 131-139 (1984).
- Pietri, J. E., Tiffany, C., Liang, D. Disruption of the microbiota affects physiological and evolutionary aspects of insecticide resistance in the German cockroach, an important urban pest. PLoS ONE. 13 (12), 0207985 (2018).
- Benschoter, C., Wrenn, R. Germfree techniques for establishment and maintenance of a colony of aseptic German cockroaches. Annals of the Entomological Society of America. 65 (3), 641-644 (1972).
- Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen Affects Gut Bacterial Colonization and Metabolic Activities in a Gnotobiotic Cockroach Model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
- Clayton, R. A simplified method for the culture of Blattella germanica under aseptic conditions. Nature. 184 (4693), 1166-1167 (1959).
- Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The Use of Peracetic Acid to Obtain Germfree Invertebrate Eggs for Gnotobiotic Studies. American Midland Naturalist. 69 (1), 231 (1963).
- Wada-Katsumata, A., et al. Gut bacteria mediate aggregation in the German cockroach. Proceedings of the National Academy of Science. 112, 15678-15683 (2015).
- Jahnes, B. C., Herrmann, M., Sabree, Z. L. Conspecific coprophagy stimulates normal development in a germ-free model invertebrate. PeerJ. 7, 6914 (2019).
- Mikaelyan, A., Thompson, C. L., Hofer, M. J., Brune, A. Deterministic Assembly of Complex Bacterial Communities in Guts of Germ-Free Cockroaches. Applied Environmental Microbiology. 82 (4), 1256-1263 (2016).
- Katoh, K., et al. Group-housed females promote production of asexual ootheca in American cockroaches. Zoological Letters. 3, 3 (2017).
- Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81 (1), 89-96 (1976).
- Bressan-Nascimento, S., Oliveira, D. M. P., Fox, E. G. P. Thermal requirements for the embryonic development of Periplaneta americana (L.) (Dictyoptera: Blattidae) with potential application in mass-rearing of egg parasitoids. Biological Control. 47 (3), 268-272 (2008).
- Nation, J. L. . Insect Physiology and Biochemistry, Second Edition. , (2008).
- House, H. L. Nutritional studies with Blattella germanica (L.) reared under aseptic conditions I. Equipment and technique. The Canadian Entomologist. 81 (5), 94-100 (1949).
- Stinson, L. F., Keelan, J. A., Payne, M. S. Identification and removal of contaminating microbial DNA from PCR reagents: impact on low-biomass microbiome analyses. Letters in Applied Microbiology. 68 (1), 2-8 (2018).
- Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform. Nucleic Acids Research. 40, 3 (2011).
- Sabree, Z. L., Kambhampati, S., Moran, N. A. Nitrogen recycling and nutritional provisioning by Blattabacterium, the cockroach endosymbiont. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 106 (46), 19521-19526 (2009).
- Ayayee, P. A., Ondrejech, A., Keeney, G., Muñoz-Garcia, A. The role of gut microbiota in the regulation of standard metabolic rate in female Periplaneta americana. PeerJ. 6, 4717 (2018).
- Krajmalnik-Brown, R., Ilhan, Z. E., Kang, D. W., DiBaise, J. K. Effects of gut microbes on nutrient absorption and energy regulation. Nutrition in clinical practice : official publication of the American Society for Parenteral and Enteral Nutrition. 27 (2), 201-214 (2012).
- Rowland, I., et al. Gut microbiota functions: metabolism of nutrients and other food components. European Journal of Nutrition. 57 (1), 1-24 (2018).
- Gier, H. T. Growth rate in the cockroach Periplaneta americana (Linn). Annals of the Entomological Society of America. 40, 303-317 (1947).
