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Biology

Etablierung und Pflege von Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana)

Published: May 28, 2021
doi:
10.3791/61316
, ,
1Department of Microbiology,University of Georgia

Summary

Dieses Protokoll wird bei der Etablierung und Aufrechterhaltung von gnotobitischen amerikanischen Kakerlaken (Periplaneta americana) verwendet, indem die Eierhüllen (Oothecae) vor dem Schlüpfen an der Oberfläche sterilisiert werden. Diese gnotobitischen Insekten enthalten ihre vertikal übertragenen Blattabacterium-Endosymbionten, haben aber axenische Eingeweide.

Abstract

Gnotobitische Tiere sind ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von Kontrollen der Struktur und Funktion des Mikrobioms. Hier wird ein Protokoll für die Etablierung und Erhaltung von gnotobitischen amerikanischen Kakerlaken (Periplaneta americana )vorgestellt. Dieser Ansatz umfasst integrierte Sterilitätsprüfungen für die laufende Qualitätskontrolle. Gnotobitische Insekten werden hier als Kakerlaken definiert, die noch ihr vertikal übertragenes Endosymbiont (Blattabacterium) enthalten, aber keine anderen Mikroben haben, die sich normalerweise auf ihrer Oberfläche und in ihrem Verdauungstrakt befinden. Für dieses Protokoll werden Eihüllen (Oothecae) aus einer (nichtsterilen) Stammkolonie entfernt und oberflächensterilisiert. Nach dem Sammeln und Sterilisieren werden die Oothecae bei 30 °C für ca. 4-6 Wochen auf Brain-Heart Infusion (BHI) Agar inkubiert, bis sie schlüpfen oder aufgrund einer Kontamination entfernt werden. Geschlüpfte Nymphen werden in einen Erlenmeyerkolben überführt, der einen BHI-Boden, steriles Wasser und steriles Rattenfutter enthält. Um sicherzustellen, dass die Nymphen keine Mikroben beherbergen, die unter den gegebenen Bedingungen nicht auf BHI wachsen können, verwendet eine zusätzliche Qualitätskontrollmaßnahme Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP), um auf nicht-dosdosymbiotische Mikroben zu testen. Gnotobiotische Nymphen, die mit diesem Ansatz erzeugt werden, können mit einfachen oder komplexen mikrobiellen Gemeinschaften geimpft und als Werkzeug in Darmmikrobiomstudien verwendet werden.

Introduction

Gnotobitische Tiere haben sich als unschätzbare Werkzeuge für Mikrobiomstudienerwiesen 1,2,3. Keimfreie und definierte Flora-Tiere haben die Aufklärung von Wirt-Mikroben-Interaktionen ermöglicht, einschließlich immunologischer Reaktionen des Wirts, der Epithelreifung des Darms und des Wirtsstoffwechsels1,4,5,6,7. Gnotobitische Tiere, die mit einer vereinfachten Gemeinschaft geimpft wurden, haben auch zu einem vollständigeren Verständnis der Mikroben-Mikroben-Interaktionen in einer Darmgemeinschaft beigetragen, insbesondere bei der Entschlüsselung von Kreuzfütterung und antagonistischen Beziehungen8,9,10,11. Das derzeit bevorzugte Modellsystem für Untersuchungen im Darmmikrobiom von Säugetieren ist das murine Modell. Während dieses System bei den oben beschriebenen Entdeckungen von entscheidender Bedeutung war, sind die damit verbundenen Kosten ein wesentliches Manko. Spezialisierte Ausrüstung und hochqualifizierte Techniker sind notwendig, um eine gnotobitische Einrichtung einzurichten und zu warten. Dies, in Kombination mit zusätzlicher Sorgfalt, die jedem Aspekt der gnotobitischen Tierpflege gewidmet werden muss, führt dazu, dass ein gnotobiotisches Tier zehn- bis zwanzigmal mehr kostet als ein Standardtiermodell12. Aufgrund hoher Kosten können sich viele Forscher möglicherweise kein gnotobiotisches Mausmodell leisten. Während murine Modelle die am weitesten verbreitete Wahl für Studien sind, die auf die menschliche Gesundheit übertragen werden sollen, gibt es immer noch viele physiologische und morphologische Unterschiede zwischen menschlichen und Mausdärmen13. Offensichtlich reicht kein singuläres Modell aus, um die ständig wachsende Anzahl von Fragen zu den vielen Aspekten des Darmmikrobioms zu beantworten.

Insektenmodelle sind aufgrund ihrer geringeren Wartungskosten im Vergleich zu Säugetierarten eine günstigere Alternative. Umfangreiche keimfreie und gnotobiotische Forschung an einer Vielzahl von Insektenarten hat zur Entwicklung mehrerer häufig verwendeter Modelle geführt. Mücken und Drosophila sind aufgrund ihrer Relevanz für globale Krankheiten und genetische Traktierbarkeit gängige Modelle für keimfreies Arbeiten14,15. Ein weiteres aufkommendes Modellsystem ist das der Honigbiene (Apis mellifera), da es für die Bestäubungs- und Sozialitätsforschungvon Bedeutung ist 16. Vielen dieser häufig verwendeten Insekten fehlt jedoch die taxonomische Komplexität, die in Säugetier-Darmgemeinschaften17beobachtet wird, was ihre Fähigkeit einschränkt, Interaktionen höherer Ordnung zu modellieren. Nicht nur, dass die gesamte Vielfalt der Mikroben, die im Darm von amerikanischen Kakerlaken gefunden werden, Säugetieren ähnlicher ist, sondern viele der im Kakerlakendarm vorhandenen Mikroben gehören zu Familien und Phyla, die häufig in der Darmmikrobiota von Säugetieren und Menschen gefunden werden18. Das Hinterdarm der Kakerlake ist auch funktionell analog zum Dickdarm von Säugetieren, da es sich um eine Fermentationskammer handelt, die dicht mit Bakterien gefüllt ist, um die Extraktion von Nährstoffen zu unterstützen19,20. Schließlich ermöglicht die Allesfresser-Natur von Kakerlaken eine Vielfalt von Diätregimen, die mit Diätspezialisten nicht möglich wären.

Amerikanische Kakerlaken können ein nützliches Modellsystem zum Verständnis der mikrobiellen Darmgemeinschaften in höheren Organismen sein, aber der Status der Kakerlake als Schädling macht dieses System auch für die Schädlingsbekämpfung relevant21. Die Nutzung grundlegender Kenntnisse über den Einfluss der Darmgemeinschaft auf die Gesundheit und Physiologie von Kakerlaken hilft bei der Entwicklung neuer Techniken zur Schädlingsbekämpfung.

Das Ziel dieser Methode ist es, eine umfassende Beschreibung der Etablierung und Aufrechterhaltung von gnotobitischen amerikanischen Kakerlaken (Periplaneta americana) zu skizzieren, aber dieses Protokoll könnte verwendet werden, um Nymphen jeder oviparen Kakerlake zu erzeugen. Es umfasst eine Methode zur effizienten, nichtinvasiven Sammlung reifer Oothekanen und eine zerstörungsfreie Technik zur Überwachung des gnotobitischen Status der Insekten22,23,24. Während frühere Methoden zur Erreichung und Aufrechterhaltung von gnotobiotischen Kakerlaken die Oothekasammlung23,24,25,26,27beschreiben, wird die Oothekareife entweder in Form von artspezifischen Hinweisen interpretiert (in Blattella germanica22,24,25) oder nicht explizit beschrieben27,28, was die Implementierung für diejenigen, die mit dem System nicht vertraut sind, erschwert. Da die hier beschriebene Methode natürlich fallengelassene Oothekanen verwendet, fehlt der Fehler, Eier vorzeitig zu entfernen. Dieses Protokoll enthält sowohl kulturabhängige als auch kulturunabhängige Methoden der Qualitätskontrolle, und die kulturabhängige Methode erfordert keine Opfer von Insekten. Schließlich führt diese Methode Informationen aus mehreren gnotobiotischen Kakerlakenstudien zusammen, um ein umfassendes Protokoll mit allen notwendigen Informationen zur Erreichung und Aufrechterhaltung von gnotobitischen Kakerlaken zu erstellen.

Protocol

1. Materialaufbereitung Pflege von KakerlakenkulturenHINWEIS: Es gibt viele Möglichkeiten, diese robusten Insekten aufzuziehen. Die Besonderheiten bei der Bereitstellung von Schutz und Wasser können je nach zugänglichen Materialien (z. B. Eierkartons anstelle von Papptuben) unterschiedlich sein. Das folgende Sterilisationsprotokoll funktioniert für jede Lagertankeinrichtung. Verteilen Sie genug Hackschnitzelbettwäsche in einem 37,85 L (10 Gallonen) Aquarium, um den Boden des Tanks mit etwa 1 Zoll Bettwäsche zu bedecken. Bereiten Sie das Gehäuse vor, indem Sie (flachen) Karton auf 2 x 4 in Stücken schneiden. Legen Sie Kartonstücke in Kartonrohre (z. B. Toilettenpapiertuben) und Stapelrohre an einem Ende des Tanks ein (Abbildung 1). Schmieren Sie eine dünne Schicht Vaseline auf die oberen zwei Zoll des Inneren des Tanks, um das Entweichen von Insekten zu verhindern.HINWEIS: Achten Sie darauf, die Innenseite der Ecken des Tanks richtig zu beschichten. Fügen Sie Kakerlaken hinzu, indem Sie (besetzte) Pappröhren aus einem früheren Lagertank übertragen und sie schütteln, um ihre Bewohner freizulassen. Bewegen Sie für jeden Transfer 100-200 gemischtgemischte, gemischtgeschlechtliche Kakerlaken. Fügen Sie Hundefutter (20-30 Stück) hinzu, überwachen Sie die Menge an Hundefutter im Tank und füllen Sie nach, wenn sie niedrig ist. Stellen Sie eine Wasserschale auf. Füllen Sie einen kleinen Wiederverwendbarenbehälter aus Kunststoff mit doppelt destilliertem Wasser (ddH2O). Zelluloseschwämme und Löcher im Deckel des Lebensmittelbehälters auf ungefähr die gleiche Größe schneiden.HINWEIS: Die Zelluloseschwämme verhindern, dass Kakerlaken in der Wasserschale ertrinken. Schwämme in Löcher im Deckel einführen und den Deckel auf den gefüllten Behälter legen. Stellen Sie den Behälter in den Tank und füllen Sie ihn nach, wenn er niedrig ist. Decken Sie den Tank mit Baumwolltuch ab und befesten Sie ihn mit einem elastischen Band. Wenn Tanks beginnen, übermäßige Mengen an Frass und Insektenkadavern anzusammeln, richten Sie neue Tanks ein und übertragen Sie Kakerlaken.HINWEIS: Tanks werden in der Regel alle 6 Monate übertragen. Alle verbleibenden Kakerlaken / Eier in stillgelegten Lagertanks werden durch Einfrieren bei -20 ° C für 1 h eingeschläfert und der Inhalt des Lagertanks wird dann vor der Entsorgung in einen Autoklavenbeutel überführt und autoklaviert (1 h, Schwerkraftzyklus). Lagertanks werden zwischen den Anwendungen mit 2% Bleichmittel sterilisiert. Desinfizieren Sie einen sekundären Behälter.HINWEIS: Dieser Behälter enthält keinen Filter, sondern ermöglicht einen freien Luftaustausch. Besprühen Sie die Innenseite des Deckels und des Bodens mit 2% Bleichmittel und lassen Sie sie 10 Minuten einweichen. Wischen Sie das Bleichmittel mit einem sauberen Papiertuch ab. Besprühen Sie die Innenseite des Deckels und des Bodens mit 70% Ethanol und wischen Sie es mit einem sauberen Papiertuch trocken. Ersetzen Sie den Deckel bis zur Verwendung. Stellen Sie BHI-Slants und -Kolben zum Inkubieren von Eiern und zum Beherbergen von Nymphen herstellen. Bereiten Sie BHI gemäß den Anweisungen der Verpackung vor und fügen Sie 2% Agar hinzu. Kochen Sie die BHI-Agarlösung bis zur Klärung. Für Slants 5 mL Aliquoten auf 18 mm x 150 mm Glas reagenzgläser und Kappe übertragen. Sterilisieren über Autoklaven (Sterilisationszeit = 20 min, Flüssigkeitszyklus). Legen Sie autoklavierte Rohre in einem Winkel von 45 °, um sie zu Schrägen abzukühlen. Nach dem Erstarren bis zum Gebrauch kühlen, um ein Austrocknen zu verhindern. Für Kolben 10 ml Aliquoten gekochter BHI-Agarlösung in 250 ml Erlenmeyerkolben geben, um den Boden des Kolbens vollständig abzudecken. Den Kolben mit Folie abdecken und per Autoklaven sterilisieren (20 min, Flüssigkeitszyklus). Autoklavkolben abkühlen lassen und kühlen, bis sie verwendet werden, um ein Austrocknen zu verhindern.HINWEIS: Für dieses Setup ist kein Luftfilter erforderlich. Die Folienabdeckung ist ausreichend, um den Gasaustausch zu ermöglichen und gleichzeitig eine Kontamination durch den Freiluftstrom zu verhindern. Sterilisieren über Autoklaven: autoklavierbare Rattensuppe in halben Größen (~1/2 Zoll Stück) in einem folienbedeckten Becherglas (Sterilisationszeit = 1 h, Schwerkraftzyklus), ddH2O in einer verschlossenen Flasche (Sterilisationszeit = 20 min, Flüssigkeitszyklus) und Eine zette in einem mit Folie überzogenen Becherglas (Sterilisationszeit = 20 min, Schwerkraftzyklus).HINWEIS: Überfüllen Sie das Rattenbecherbecherglas nicht. Pellets schwellen im Autoklaven an. Richten Sie einen Tank für die “Entbindungsstation” ein.HINWEIS: Dieser Tank enthält die gleichen Materialien wie die Lagertanks (Kartonschläuche, Wasserschalen mit Schwämmen, Hundefutter, Hackschnitzelbettwäsche; siehe Abbildung 1) und sollte leer von Kakerlaken sein, es sei denn, er wird zur Oothekensammlung übertragen (siehe Abschnitt 2). Befeuchten Sie einen Inkubator, indem Sie ein Becherglas voller übersättigter Natriumchlorid (NaCl) -Lösung vorbereiten. Bereiten Sie diese Lösung vor, indem Sie 37 g NaCl pro 100 mlddH2O hinzufügen und rühren, bis sie gelöst sind.HINWEIS: Typischerweise befeuchten 500 ml gesättigte Salzlösung typischerweise einen Inkubator mit den Kammerabmessungen 51 cm x 46 cm x 46 cm (H x B x T) für etwa einen Monat, bevor mehr Wasser hinzugefügt werden muss. 2. Sammlung von Oothecae Übertragen Sie Weibchen (in beliebiger Anzahl, je nach geplanten Experimenten), die Oothekane(Abbildung 2)tragen, vom Lagertank zur “Entbindungsstation”, indem Sie mit einer Zette Kartonröhren bewegen, die gravide Weibchen enthalten. Wenn ein Kartonrohr neben dem graviden Weibchen mehrere Insekten enthält, schütteln Sie das Rohr zuerst in einen zusätzlichen Kunststoffbehälter, der mit Vaseline beringt ist, und ermutigen Sie dann das Zielinsekt, allein in das Papprohr zurückzuklettern. Übertragen Sie die Weibchen zurück in den Lagertank, sobald sie ihre Oothecae fallen gelassen haben. Holen Sie die Oothecae mit einer Zette aus dem Wurf im Tank.HINWEIS: Oothecae werden oft innerhalb von 24 Stunden nach dem Transfer des Weibchens fallen gelassen. 3. Reinigung von Oothecae Oothekane in ein 5-ml-Zentrifugenröhrchen mit 3 ml Natriumdodecylsulfat (SDS) geben. Wirbel für 10 s. Wiederholen Sie den zweiten Waschschritt mit einem Zentrifugenröhrchen, das frisches SDS enthält.HINWEIS: Pro 3 ml SDS können bis zu fünf Oothecae verwendet werden. Mit einem zarten Aufgabentuch die Oberfläche jeder Oothek vorsichtig schrubben, um Ablagerungen zu entfernen. Weitere SDS können hinzugefügt werden, um die gründliche Reinigung zu unterstützen. Reinigene Oothecae in ein Wiegeboot geben, bis sie zur Sterilisation bereit sind.HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden, aber wenn sie die Ootheken für längere Zeit (Tage bis Wochen) in Umgebungen mit niedriger Luftfeuchtigkeit belassen, werden sie dehydrieren und ihre Lebensfähigkeit verlieren. 4. Sterilisation und Inkubation von Oothecae Aliquot steriles Wasser für die Nachsterilisation spülen. Füllen Sie für jede zu sterilisierende Oothek zwei 1,5 ml Zentrifugenröhrchen mit 1 ml sterilem Wasser. Fügen Sie 10 μL konzentriertes (32%) Peressigsäure-Stammlösung zu 3,2 mlddH2 O in einem 5-ml-Zentrifugenröhrchen, um eine 0,1% ige Lösung für die Sterilisation zu erzeugen. Kappen und mehrmals umkehren, um zu mischen.VORSICHT: Peressigsäure ist schädlich bei Kontakt mit Haut oder Lunge. In einem Abzug verdünnen.HINWEIS: Dies muss am selben Tag wie die Sterilisation erfolgen. Wenn die Lösung im Voraus verdünnt wird, zersetzt sie sich schnell und sterilisiert daher nicht richtig. Bis zu fünf gereinigte Oothekane können in 3,2 ml verdünnter Säure sterilisiert werden. (bis zu fünf) gereinigte Oothecae für 5 min in die 0,1% ige Peressigsäurelösung geben. Kehren Sie das Rohr mehrmals alle 60 s um. Verwenden Sie in einer Laminar-Flow-Haube eine sterile Zinnen, um jede Oothek mit aliquoteiertem sterilem Spülwasser in ein eigenes Zentrifugenröhrchen zu überführen (Schritt 4.1). Mehrmals umkehren, um zu mischen. Wiederholen Sie dies für eine zweite Spülung und übertragen Sie dann jede gespülte Oothek mit einer sterilen Handzette in ihre eigene BHI-Neigung. Legen Sie Schrägen in den sterilisierten Sekundärbehälter. Den Behälter 4−5 Wochen lang bei 30 °C in den befeuchteten Inkubator bringen, bis er geschlüpft ist.HINWEIS: Slants können von einem kleinen Reagenzglasgestell oder einem mittleren/kleinen Becherglas aufrecht gehalten werden. Überprüfen Sie die Slants regelmäßig (1-2x pro Woche). Wenn Pilz- oder Bakterienkoloniewachstum auf dem Agar auftritt, entfernen Sie die kontaminierte Neigung. Wenn sich der Vier-Wochen-Zeitpunkt nähert, überprüfen Sie jeden Tag die Neigungen.HINWEIS: Einmal geschlüpft, können Nymphen bis zu mehreren Wochen allein auf BHI überleben, wachsen aber nicht optimal. 5. Erhaltung von gnotobitischen Nymphen In einer Laminar-Flow-Haube wird ein Pellet sterilisierter Rattensuppe aseptisch mit einer sterilen Zette in einen vorbereiteten BHI-Kolben (ab Schritt 1.3.3) überführen. Als Sterilitätsprüfung den Kolben 24 h lang in den Sekundärbehälter in einen 30 °C-Inkubator geben und nicht verwenden, wenn Wachstum auftritt. Nymphen mit sterilem Futterpellet in den BHI-Kolben geben. Schütteln Sie sie aus ihrer BHI-Neigung und lassen Sie sie in einer laminaren Strömungshaube in den Kolben fallen.HINWEIS: Die Nymphen haben keine Traktion an den Glaswänden des Reagenzglases. Das Schütteln des Rohrs, um sie von der Schräge abzustoßen, und dann das Kippen des Rohrs, damit sie das Glas in den Kolben gleiten können, ist effektiv. Während Nymphen mit einer Zette übertragen werden können, ist das Risiko tödlicher Verletzungen hoch. Wassernymphen mit 300 μL sterilem Wasser einmal pro Woche in einer Laminar-Flow-Haube durch Pipettieren direkt auf den BHI-Boden des Kolbens. Wenn Nymphenkot beginnt, den BHI-Boden zu bedecken, in einen neuen BHI-Kolben übergehen und den sterilisierten Rattenchow 24 Stunden im Voraus hinzufügen (um die Sterilität zu überprüfen) wie in Schritt 5.1. 6. Qualitätskontrolle der Sterilität Entfernen Sie eine Nymphe aus dem BHI-Kolben, um für eine kulturunabhängige Qualitätskontrolle des gnotobitischen Status mittels Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) zu opfern. Gießen Sie dazu die Nymphe in ein steriles Zentrifugenröhrchen (ähnlich dem Nymphentransfer ab Schritt 5.1) oder legen Sie einen sterilen Holzapplikator in den Kolben und warten Sie, bis eine Nymphe mit dem Klettern beginnt, und übertragen Sie ihn dann in das Zentrifugenröhrchen. 0,5 ml 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in die Nymphe im Zentrifugenröhrchen geben und mit einer sterilen Mikropest homogenisieren, bis alle großen Stücke zerbrochen sind. Vortex gut. Extrahieren Sie DNA aus Nymphenhomogenat mit einembakteriellen DNA-Extraktionskit( Materialtabelle ) wie folgt. Zentrifuge die homogenisierte Nymphe für 10 min bei 5.000 x g und entferne den Überstand. Einen Thermoschüttler auf 37 °C vorheizen. Fügen Sie 100 μL 1x Tris-EDTA und Wirbel hinzu, um das Pellet vollständig wieder aufzubestellen. 10 μL Lysozym fügen und mischen, gefolgt von einer 30-minütigen (kein Schütteln) Inkubation im vorgewärmten 37 °C Thermoschüttler. Fügen Sie 25 mg Glasperlen zu den Proben hinzu und wirbeln Sie mit maximaler Geschwindigkeit für 5 minuten. Den Thermoschüttler auf 55 °C vorheizen. Lassen Sie die Perlen absetzen, bevor Sie den Überstand in ein neues 1,5 ml Zentrifugenröhrchen mit 100 μL Proteinase K-Puffer und 20 μL Proteinase K übertragen. Inkubieren Sie mit Schütteln bei 600 U / min in einem 55 °C Thermoschüttler für 60 min. Zentrifuge bei 10.000 x g für 2 min und überstand in ein neues 1,5 ml Zentrifugenrohr übertragen. Den Thermoschüttler auf 65 °C vorheizen. Beginnen Sie mit dem Vorwärmen des Elutionspuffers in einem 65 °C Hybridisierungsofen. Fügen Sie 220 μL 100% Ethanol hinzu. Wirbel bei maximaler Geschwindigkeit für 20 s. Brechen Sie sichtbare Niederscheidung auf, indem Sie 10x auf und ab pipettieren. Führen Sie eine DNA-Säule in ein 2-ml-Sammelröhrchen ein und übertragen Sie die Probe in die Säule, einschließlich aller Ausfällungen, die sich möglicherweise gebildet haben. Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 1 min, entsorgen Sie Filtrat aus dem Sammelrohr und ersetzen Sie das Auffangrohr. Fügen Sie 500 μL Bindungspuffer zur Säule hinzu und zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 1 min. Entsorgen Sie Filtrat aus dem Sammelrohr und ersetzen Sie das Auffangröhrchen. 700 μL DNA-Waschpuffer in die Säule geben und bei 10.000 x g zentrifugieren für 1 min. Entsorgen Sie Filtrat aus dem Sammelrohr und ersetzen Sie das Auffangröhrchen. Wiederholen Sie dies für einen zweiten Waschschritt. Zentrifugieren Sie die leere Säule für 2 min, um sie zu trocknen, und übertragen Sie die Säule anschließend in ein neues 1,5-ml-Zentrifugenrohr. 50 μL vorgewärmter Elutionspuffer direkt in die DNA-Säulenmatrix geben und bei 65 °C für 5 min inkubieren. Zentrifuge bei 10.000 x g für 1 min zu eluierten. Quantifizieren Sie die extrahierte DNA im Filtrat mittels Spektrophotometrie oder Fluorometrie. Amplifizieren und verdauen Sie das ganze 16S-Gen. Visualisieren Sie Fragmente mit Gelelektrophorese. Verwenden Sie 12,5 μL 2x Master-Mix, 0,5 μL jedes Primers 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT) und 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG), 5 ng DNA und molekulares Wasser für ein Gesamtreaktionsvolumen von 25 μL. Führen Sie das folgende Thermocycler-Programm aus: 94 °C für 60 s; gefolgt von 35 Zyklen von 94 °C für 30 s, 50 °C für 45 s, 68 °C für 90 s; gefolgt von 68 °C für 5 min. Reinigen Sie das Polymerase-Kettenreaktionsprodukt (PCR) mit einem DNA-Reinigungskit (Table of Materials). Fügen Sie dem PCR-Produkt 120 μL Reinigungspuffer hinzu und mischen Sie den Wirbel. Kurz zentrifugiert, um Tröpfchen im Deckel zu sammeln. Eine DNA-Säule in ein 2 ml Sammelröhrchen einführen, die Flüssigkeit in die vorbereitete Säule geben und bei ≥13.000 x g für 1 min zentrifugieren. Entsorgen Sie das Filtrat und ersetzen Sie das Auffangrohr. 700 μL DNA-Waschpuffer und Zentrifuge bei ≥13.000 x g für 1 min hinzufügen. Entsorgen Sie das Filtrat und ersetzen Sie das Auffangrohr. Wiederholen Sie dies für einen zweiten Waschschritt. Zentrifugieren Sie die leere Säule für 2 min zum Trocknen und übertragen Sie die Säule in ein neues 1,5 ml Zentrifugenrohr. 50 μL vorgewärmter Elutionspuffer direkt in die DNA-Säulenmatrix geben und bei Raumtemperatur für 2 min inkubieren. Zentrifuge bei 10.000 x g für 1 min zu eluierten. Quantifizieren Sie die extrahierte DNA in Filtrat mittels Spektrophotometrie oder Fluorometrie. 1 μg gereinigtes PCR-Produkt zu 5 μL Aufschlusspuffer, 10 Einheiten RsaI und molekularem Wasser für ein Gesamtreaktionsvolumen von 50 μL geben. Mischen Sie durch Pipettieren auf und ab und inkubieren Sie bei 37 °C für 60 min. Trennen Sie das verdaute Produkt durch Gelelektrophorese, indem Sie 20 μL verdaute DNA auf ein 2% iges Agarosegel laufen lassen. Visualisieren Sie das Gel, um den gnotobitischen Status zu bestätigen.HINWEIS: Gnotobiotische Insekten sollten nur zu Bändern bei 402 bp, 201 bp und einem Abstrich von 163 bis 148 bp führen, basierend auf der 16S rDNA-Sequenz des Endosymbionten Blattabacterium. Alle zusätzlichen Bänder, die im Gel zu sehen sind, deuten auf eine Kontamination mikrobieller Spezies hin. 7. Aseptische Verfolgung des Nymphenwachstums Zeichnen Sie die Körperlänge auf, um das Nymphenwachstum zu verfolgen, indem Sie die Insekten durch den durchscheinenden BHI-Boden des Kolbens messen.HINWEIS: Nymphen können für 15 Minuten bei 4 ° C platziert werden, um ihre Bewegung zu verlangsamen und dadurch leichter zu messen.

Representative Results

Lagertanks werden wie in Abbildung 1dargestellt aufgestellt. “Schwangere” Weibchen werden durch die Oothek identifiziert, die am hinteren Bauch befestigt ist, wie in Abbildung 2 dargestellt. Die Inkubation von Oothecae auf BHI-Agar ermöglicht eine zerstörungsfreie gnotobitische Qualitätskontrolle. In einigen Fällen ist die Sterilisation nicht erfolgreich, und das Wachstum erscheint um die Ootheka herum, wie in Abbildung 3B. Diese Oothekanen sollten entfernt und entsorgt werden. In unseren Händen wurde eine durchschnittliche Ausfallrate von 10% für die Sterilisation beobachtet (n = 51). Die Ootheken schlüpfen durchschnittlich 34 Tage nach der Sterilisation ohne Wachstum auf dem Medium, wie in Abbildung 3A zu sehenist. Wir haben typische Schlupfraten von 41% (n = 46) für sterilisierte, nicht kontaminierte Ootheken beobachtet, mit durchschnittlich 11 Nymphen pro Oothek. Größere Nymphen werden in BHI-Kolben überführt, die mit Folie bedeckt sind, wie in Abbildung 4dargestellt. Die Folie verhindert eine Kontamination, und die Nymphen haben Platz zum Wachsen. RFLP der 16S rDNA von einer homogenisierten Nymphe wird verwendet, um den gnotobiotischen Status zu bestätigen. Es wurde beobachtet, dass gnotobitische Nymphen langsamer wachsen als ihre nicht sterilen Gegenstücke, wie abbildung 5 dargestellt. Abbildung 6 zeigt Ergebnisse von erfolgreich gnotobitischen Insekten sowie Standardnymphen (nichtsterilen) Nymphen. Während dieser Test noch keine Kontamination in Ermangelung eines positiven Kulturergebnisses identifiziert hat, wurde dieser Schritt routinemäßig während kritischer Experimente durchgeführt, um das Vorhandensein von kontaminierenden sauerstoffempfindlichen oder anspruchsvollen Mikroben auszuschließen. Ein langsameres Wachstum wurde bei den gnotobiotischen Kakerlaken im Vergleich zu Standard- / nichtsterilen Insekten beobachtet. Abbildung 1: Aufbau der Kakerlaken-Bestandskultur.Kartonrohre sind am anderen Ende des Tanks gestapelt zu sehen. Essen und Wasser befinden sich beide in der Nähe der Vorderseite des Tanks. Baumwolltuchbezug und Gummiband wurden aus Sichtgründen entfernt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Eine “schwangere” amerikanische Kakerlake.Der Pfeil zeigt die Ootheka an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Bilder von erfolgreich gnotobitischen Nymphen, die auf BHI-Slants geschlüpft und erfolglos sterilisiert wurden.Oothecae wurden sterilisiert und inkubiert, wie in diesem Protokoll beschrieben. (A) Das Fehlen eines mikrobiellen Wachstums auf der BHI-Neigung deutet darauf hin, dass die Insekten frei von kultivierbaren Organismen sind. (B) Oothecae auf Slants, die zur Koloniebildung führen, sollten als kontaminiert verworfen werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Gnotobiotischer Aufzuchtapparat.Insekten werden in sterilen Kolben gehalten, die mit einem Foliendeckel bedeckt sind, um eine Kontamination zu verhindern. Der sekundäre Behälter (grüner Deckel) wird mit 2% Bleichmittel sterilisiert, gefolgt von 70% Ethanol. Der Luftstrom ist im Sekundärbehälter nicht eingeschränkt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Repräsentative Wachstumsratendaten, die Körperlängen von gnotobitischen und nichtsterilen Nymphen vergleichen. Beide Insektengruppen wurden mit autoklavierten Nagetieren gefüttert. Gnotobiotische Insekten (hier: n = 105) werden wie beschrieben auf BHI gehalten. Nichtsterile Insekten (hier: n = 50) leben in Kolben mit autoklaviertem Hackschnitzelbett mit kleinem Geschirr für Wasser. Nichtsterile Nymphen wachsen durchschnittlich 0,059 mm / Tag, während gnotobitische Nymphen mit 0,028 mm / Tag wachsen (p < 0,0001). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6: Ein repräsentatives Gelbild der RFLP-Ergebnisse zur Qualitätskontrolle.Whole-16S-Genamplikone wurden mit RsaI verdaut. DNA für PCR wurde aus Nymphen extrahiert, die in 1x PBS homogenisiert wurden. “G Nymph” -Bahnen entsprechen gnotobitischen Nymphen, während “Kon-Nymphen” -Bahnen konventionellen, nichtsterilen Gegenstücken entsprechen. Basierend auf der virtuellen Restriktionsverdauung wird erwartet, dass das Endosymbiont (Blattabacterium) Bänder in den Größen 402 bp, 206 bp und 163 bp mit einem Abstrich von Bändern zwischen 163 bp und 148 bp aufwies. Ein gnotobiotisches Insekt sollte nur das Blattabacterium-Banding-Muster zeigen. Es wird erwartet, dass eine gemischte Bakteriengemeinschaft einen Abstrich von Bändern mit unterschiedlichen Größen hat, die hier als “andere bakterielle 16S-Fragmente” bezeichnet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Andere Methoden, die die Erzeugung von gnotobitischen Kakerlaken beschreiben, beschrieben entweder nicht die Oothecae-Sammlung oder verwendeten Benchmarks, die für andere Kakerlakenarten spezifisch waren, um anzugeben, wann die Ootheken von der Mutter entfernt werdenkonnten23,25,26. Ursprünglich wurden Oothekane aus der Hackschnitzeleinstreuung in den Lagertanks gesammelt, was zu sehr niedrigen Lukenraten (~ 10%) im Vergleich zu nichtsterilisierten Oothecae (47%)29. Dies ist wahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass sich ungeschlüpfte Ootheken im Laufe der Zeit im Bestandskäfig ansammeln, und es gibt keine Möglichkeit, das Alter oder die Lebensfähigkeit der Ootheka zu überprüfen. Die Implementierung des Ansatzes der “Entbindungsstation” ermöglicht die Sammlung von frisch abgelagerten Oothekanen bekannten Alters. Dies erleichtert die experimentelle Planung weiter, da der Forscher wahrscheinliche Brutzeiten für einzelne Oothecae vorhersehen kann. Eine weitere Modifikation der ursprünglichen und veröffentlichten Protokolle umfasst die Inkubation von Ootheken und Nymphen in halbversiegelten Kammern, die auch eine übersättigte Natriumchloridlösung enthalten. Das Vorhandensein der Lösung hält eine relative Luftfeuchtigkeit von etwa 75%30aufrecht. Oothecae werden routinemäßig bei 30 °C inkubiert, was nachweislich die Anzahl der für die Inkubation erforderlichen Tage minimiert und gleichzeitig die Lebensfähigkeit der Embryonen und die Anzahl der pro Oothek produzierten Nymphen maximiert31. Nach dem Schlüpfen werden gnotobitische Nymphen routinemäßig auf dem Tisch bei Laborraumtemperatur und Umgebungsbedingungen kultiviert, obwohl feuchtigkeitsgesteuerte Kammern wiederum für kritische Experimente verwendet werden. Nach Feststellung dieser Veränderungen bei der Oothekasammlung und -inkubation stiegen die Schlupfraten auf etwa 41% (n = 51), ohne Ootheken, die aufgrund von Kontamination entfernt wurden. Ein möglicher Weg zur weiteren Optimierung der Lukenraten kann die Verlängerung der Zeit zwischen Oothekensammlung und Sterilisation sein. Die Nagelhaut des Eikoffers ist bei der ersten Freisetzung32möglicherweise nicht vollständig gebräunt und kann daher innerhalb von 24 h nach dem Fallen durchlässig für Lösungen sein, die während der Sterilisation verwendet werden.

Das Sterilisationsprotokoll mit 0,1% Peressigsäure wurde von Doll et al.25adaptiert. Andere Studien haben alternative Techniken zur Sterilisation von Oothecaedokumentiert 23,26. Die Kontaminationsraten basieren auf der zerstörungsfreien Methode der Inkubation der Oothecae auf einer BHI-Neigung. Dieser Ansatz ist sehr vorteilhaft, da er eine schnelle Identifizierung und Entfernung von kontaminierten Ootheken ermöglicht. Die meisten früheren Protokolle testen auf kultivierbare Organismen, indem Kot oder Nymphenhomogenat auf bakteriologischen Medien plattiert und auf Wachstum überprüft wird22,23,25,27,28,33. In mindestens einem Fall wurde die Methode zur Prüfung des gnotobitischen Status nicht vollständig beschrieben26. Mit Ausnahme von Clayton, der eine kleine Platte Sterilitätstestmedium zu Aufzuchtflaschen24hinzufügte, beherbergten frühere Methoden22,23 gnotobitische Insekten nur für kurze Zeit auf bakteriologischen Medien, um das Sterilisationsprotokoll zunächst zu bewerten.

Die fortgesetzte Unterbringung der resultierenden Nymphen auf BHI-Medium als integrierte Qualitätskontrollmaßnahme ermöglicht es, ihren gnotobitischen Status in Halb-Echtzeit zu überwachen – eine Technik, die in den meisten vorherigen Methoden nicht zu sehen war22,23. Dies ist besonders nützlich für Langzeitexperimente, bei denen auf gnotobiotische Nymphen zugegriffen werden muss. Wenn der BHI-Boden unter Nymphen mit Bakterien- oder Pilzwachstum kontaminiert erscheint, sollte der Kolben entsorgt werden. Diese Art der Kontamination tritt typischerweise auf, wenn die Kolben zu Wassernymphen aufgedeckt werden, aber sie kann auch aus dem Kot im Falle von unzureichend sterilisierten Ootheken oder Lebensmitteln entstehen. Die Verwendung einer Laminar-Flow-Haube beim Gießen verbessert die Kontaminationsrate, die durch das Aufdecken von Kolben verursacht wird.

Da nicht alle kontaminierenden Organismen auf BHI-Medium aerob wachsen können, ist eine zusätzliche kulturunabhängige Methode der Sterilitätsprüfung erforderlich. Ein möglicher Ansatz ist dieMikroskopie 27, aber dieser Ansatz kann arbeitsintensiv sein. Andere Protokolle verwenden sequenzbasierte Techniken, um Organismen nachzuweisen, die der Kultur14,23,27,28entkommen können. Solche Ansätze sind jedoch oft teuer und schwer zu interpretieren, da die Ergebnisse von Hochdurchsatz-Sequenzierungsansätzen leicht durch eine geringe Kontamination von Reagenzien34 und Barcode-Hopping35beeinflusst werden können. Stattdessen wurde ein neuer Ansatz entwickelt, der die PCR-Amplifikation des 16S-rRNA-Gens in Kombination mit einem Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus verwendet, um sowohl den Endosymbionten als auch alle kontaminierenden Darmsymbionten sichtbar zu machen. Diese Technik beinhaltet eine interne PCR-Kontrolle, da das 16S-Gen von Blattabacteriumsequenziert wurde und sein Bandierungsmuster sowohl bei gnotobitischen als auch bei nichtsterilen Insekten vorhanden sein sollte. Da das Restriktionsmuster des Endosymbionten anhand seiner Genomsequenz36vorhergesagt werden kann, besteht keine Notwendigkeit, die Amplicons oder die Restriktionsfragmente zu sequenzieren, es sei denn, die Identifizierung eines Schadstoffs ist erwünscht. Die aktuelle Version dieses Protokolls fordert, dass eine Nymphe für PCR / RFLP geopfert wird, aber diese Technik könnte auch bei Kot als zerstörungsfreie Maßnahme verwendet werden. Es wird jedoch keine eingebaute Kontrolle enthalten, da der Kot nicht viel Blattabacteriumenthalten sollte.

Eine zusätzliche leicht modifizierbare, aber kritische Komponente der Aufzucht von gnotobitischen Tieren ist die Ernährung. Während BHI-Agar als vorübergehende Nahrungsquelle für die Insekten dienen kann, wurde festgestellt, dass es zu erheblichen Wachstumsdefiziten bei Nymphen führt, wenn es für längere Zeit als einzige Nahrungsquelle verwendet wird. Während verschiedene Diäten ausprobiert wurden, wird autoklavierbares Rattenchow als Routinediät für die Erhaltung von gnotobiotischen Insekten empfohlen. Diäten, die nicht speziell für die Sterilisation formuliert wurden, waren oft schwer vollständig steril zu machen, und viele sterile oder autoklavierbare Labortierdiäten zeigten unter nichtsterilen Bedingungen ein schnelles Pilzwachstum. Diese Tendenz zum Abbau unter nichtsterilen Bedingungen machte sie ungeeignet für Experimente, in denen gnotobiotische und nichtgnotobitische Insekten direkt verglichen wurden. Die empfohlene Diät ermöglicht die Verwendung einer konsistenten Diät zwischen gnotobitischen und Standardnymphen, was den Vergleich von Merkmalen – wie Wachstumsraten – zwischen den beiden Gruppen erleichtert.

Wie andere beobachtet haben27, wachsen die gnotobitischen Nymphen langsamer als ihre nichtsterilen Gegenstücke. Ein Vergleich zwischen Körperlängen von gnotobitischen (n = 105) und nichtsterilen Nymphen (n = 50), die mit der gleichen, autoklavierten Nagetiernahrung gefüttert und bei Raumtemperatur gehalten werden, zeigt, dass nichtsterile Nymphen durchschnittlich 0,059 mm / Tag wachsen, während gnotobitische Nymphen 0,028 mm / Tag wachsen (p < 0,0001) (Abbildung 5). Es wurde gezeigt, dass das Vorhandensein von Darmmikrobiota in P. americana die Stoffwechselrate der Insekten verändert37, und es wird angenommen, dass Darmgemeinschaften im Allgemeinen die Nährstoffaufnahme beeinflussen38,39. Diese Gründe unterstützen die beobachteten Unterschiede in der Wachstumsrate von gnotobitischen und nichtsterilen Nymphen.

Eine mögliche Einschränkung dieser Technik ist, dass gnotobitische Nymphen möglicherweise nicht die Geschlechtsreife erreichen, da die ältesten sterilen Kohorten mehr als 10 Monate alt sind und nur den siebten Instar (von 10; 11 im Erwachsenenalter) erreicht haben, wie durch Körperlänge40angenähert. Diese ältesten Kohorten sind nicht auf der Autoklavenrattendiät, sondern essen stattdessen bestrahltes Rattenchow, eine Diät, die zu viel Feuchtigkeit enthält, um nichtsterile Kohorten ohne übermäßiges Schimmelwachstum zu füttern. Es wurde festgestellt, dass nichtsterile Nymphen auf einer nichtsterilisierten Hundefutterdiät nach 9-10 Monaten unter Laborbedingungen (Raumtemperatur und Luftfeuchtigkeit) das Erwachsenenalter erreichen. Kohorten von gnotobitischen und nichtsterilen Nymphen auf dem gemeinsamen, autoklavierten Rattenchow sind derzeit weniger als 7 Monate alt, nichtsterile Insekten werden auf den siebten Instar geschätzt (Durchschnitt: 16,7 mm), während sterile Insekten auf den fünften Instar geschätzt werden (Durchschnitt: 11,2 mm). Infolgedessen können wir noch nicht überprüfen, ob sich unsere gnotobiotischen Kakerlaken erfolgreich vermehren können. Angesichts der Leichtigkeit, mit der neue gnotobitische Kohorten mit diesem Ansatz etabliert werden können, ist diese Methode jedoch auch ohne nachgewiesene Fortpflanzung von gnotobitischen Insekten vielversprechend.

Zusammenfassend bietet dieses Protokoll ein vielseitiges Werkzeug, das es Mikrobiomforschern ermöglicht, ihre eigene, kostengünstige gnotobiotische “Einrichtung” mit gängigen Labormaterialien zu betreiben. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um gnotobiotische Kakerlaken für Experimente zu generieren, die die Rolle der Mikrobiota bei der Gestaltung des Wirtsverhaltens, der Immunität, der Entwicklung und der Stressreaktionen untersuchen21,26,27. Diese gnotobitischen Insekten können auch mit synthetischen oder xenobiotischen Gemeinschaften geimpft und anschließend als Probanden für Darmmikrobiomstudien verwendet werden23,28. Darüber hinaus sind Elemente dieses Ansatzes, einschließlich der Verwendung bakteriologischer medienarmer Inkubationskammern als integrierte Sterilitätsprüfung, auf andere Modellsysteme verallgemeinerbar und können die routinemäßige Wartung von gnotobitischen Tieren in kleineren Einrichtungen erleichtern.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Publikation wurde vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health unter der Vergabenummer R35GM133789 unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Ansicht der National Institutes of Health dar. Die Autoren möchten Josey Dyer für die Verfolgung von Sterilisationsraten, Lukenraten und Wachstumsraten der gnotobiotischen Kakerlaken danken.

Materials

2X master mix New England BioLabs M0482 OneTaq MasterMix
Autoclavable rat chow Zeigler NIH-31 Modified Auto
Bacterial DNA extraction kit Omega Bio-Tek D-3350 E.Z.N.A. Bacterial DNA kit; includes lysozyme, glass beads, proteinase K, buffers (proteinase K, binding, wash, elution), DNA columns, 2-mL collection tube
binding buffer Omega Bio-Tek PD099 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("HBC" buffer)
brain-heart infusion (BHI) broth Research Products International B11000
Delicate task wipes KimWipe JS-KCC-34155-PK KimWipes
DNA purification kit Omega Bio-Tek D6492 E.Z.N.A. Cycle Pure kit; D6493 may also be used; includes buffers (purifying ,wash, elution)
elution buffer Omega Bio-Tek PDR048 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
glass beads Omega Bio-Tek n/a included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
Hybridization oven UVP 95-0330-01 we use a hybridization oven for preheating elution buffer, but a water bath could probably also be used
Laminar flow biological safety cabinet NuAire, Inc. NU-425-400 Protocol refers to this as "laminar flow hood" for brevity
lysozyme Omega Bio-Tek n/a included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
peracetic acid stock solution (32%) Sigma-Aldrich 269336
Petroleum jelly Vaseline n/a
proteinase K buffer Omega Bio-Tek PD061 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("TL buffer")
purifying buffer Omega Bio-Tek PDR042 included in Omega Biotek's CyclePure kit ("CP" buffer)
RsaI New England BioLabs R0167 Includes CutSmart (digestion) buffer
Secondary container n/a n/a a plastic container with a lid (such as a Kritter Keeper) works well for this (25cm long x 15cm wide x 22cm high); it should be large enough to fit BHI slants and test tubes
spectrophotometer ThermoFisher ND-2000 Catalog info is for NanoDrop2000
thermal shaker Eppendorf EP5386000028 Thermomixer R
Tris-EDTA Fisher BP1338-1 10 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8
wash buffer Omega Bio-Tek PDR044 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("DNA wash" buffer)
Woodchip bedding P.J. Murphy Forest Products Sani-Chips
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Dukes, H. E., Dyer, J. E., Ottesen, E. A. Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana). J. Vis. Exp. (171), e61316, doi:10.3791/61316 (2021).
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