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Biology

Establecimiento y Mantenimiento de Cucarachas Americanas Gnotobiotic (Periplaneta americana)

Published: May 28, 2021
doi:
10.3791/61316
, ,
1Department of Microbiology,University of Georgia

Summary

Este protocolo se utiliza en el establecimiento y mantenimiento de cucarachas americanas gnotobióticas (Periplaneta americana) mediante la esterilización superficial de las cajas de huevos (ootecas) antes de la eclosión. Estos insectos gnotobióticos contienen sus endosimbiontes de Blattabacterium transmitidos verticalmente, pero tienen intestinos axénicos.

Abstract

Los animales gnotobióticos son una herramienta poderosa para el estudio de los controles sobre la estructura y función del microbioma. Aquí se presenta un protocolo para el establecimiento y mantenimiento de cucarachas americanas gnotobióticas (Periplaneta americana). Este enfoque incluye comprobaciones de esterilidad incorporadas para el control de calidad continuo. Los insectos gnotobióticos se definen aquí como cucarachas que todavía contienen su endosimbionte transmitido verticalmente (Blattabacterium) pero carecen de otros microbios que normalmente residen en su superficie y en su tracto digestivo. Para este protocolo, las cajas de huevos (ootecas) se eliminan de una colonia de ganado (no esterilizada) y se esterilizan en la superficie. Una vez recolectadas y esterilizadas, las ootecas se incuban a 30 °C durante aproximadamente 4-6 semanas en agar infusión cerebro-corazón (BHI) hasta que eclosionan o se eliminan debido a la contaminación. Las ninfas eclosionadas se transfieren a un matraz de Erlenmeyer que contiene un piso de BHI, agua estéril y alimento estéril para ratas. Para asegurarse de que las ninfas no albergan microbios que no pueden crecer en BHI en las condiciones dadas, una medida de control de calidad adicional utiliza polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP) para probar microbios no adosimbióticos. Las ninfas gnotobióticas generadas con este enfoque pueden inocularse con comunidades microbianas simples o complejas y utilizarse como herramienta en estudios de microbioma intestinal.

Introduction

Los animales gnotobióticos han demostrado ser herramientas invaluables para los estudios de microbiomas1,2,3. Los animales libres de gérmenes y de flora definida han permitido la elucidación de las interacciones huésped-microbio, incluidas las respuestas inmunológicas del huésped, la maduración epitelial intestinal y el metabolismo del huésped1,4,5,6,7. Los animales gnotobióticos inoculados con una comunidad simplificada también han ayudado a una comprensión más completa de las interacciones microbio-microbio en una comunidad intestinal, específicamente en el desentrañamiento de la alimentación cruzada y las relaciones antagónicas8,9,10,11. El sistema modelo preferido actual para los estudios en el microbioma intestinal de los mamíferos es el modelo murino. Si bien este sistema ha sido vital en los descubrimientos descritos anteriormente, una deficiencia clave es el costo involucrado. El equipo especializado y los técnicos altamente entrenados son necesarios establecer y mantener una facilidad gnotobiotic. Esto, en combinación con el cuidado adicional que se debe dar a cada aspecto del mantenimiento animal gnotobiotic, hace que el animal gnotobiotic cueste diez a veinte veces más para criar que un modelo animal estándar12. Debido a los altos costos, muchos investigadores pueden ser incapaces de pagar un modelo murino gnotobiótico. Además, si bien los modelos murinos pueden ser la opción más ampliamente aceptada para los estudios que buscan traducirse a la salud humana, todavía hay muchas diferencias fisiológicas y morfológicas entre las tripas humanas y de ratón13. Claramente, ningún modelo singular es suficiente para responder al número cada vez mayor de preguntas sobre los muchos aspectos del microbioma intestinal.

Los modelos de insectos son una alternativa más barata debido a su menor costo de mantenimiento en comparación con las especies de mamíferos. La extensa investigación libre de gérmenes y gnotobióticos en una variedad de especies de insectos ha llevado al desarrollo de múltiples modelos de uso común. Los mosquitos y Drosophila son modelos comunes para el trabajo libre de gérmenes debido a su relevancia para las enfermedades globales y la tratabilidad genética14,15. Otro sistema modelo emergente es el de la abeja melífera (Apis mellifera), dada su importancia en la polinización y la investigación de la socialidad16. Sin embargo, muchos de estos insectos de uso común carecen de la complejidad taxonómica observada en las comunidades intestinales de mamíferos17,lo que limita su capacidad para modelar interacciones de orden superior. No sólo la diversidad total de microbios que se encuentran en el intestino de las cucarachas americanas es más similar a la de los mamíferos, sino que muchos de los microbios presentes en el intestino de las cucarachas pertenecen a familias y filos que se encuentran comúnmente en la microbiota intestinal de mamíferos y humanos18. El intestino posterior de la cucaracha también es funcionalmente análogo al intestino grueso de los mamíferos, ya que es una cámara de fermentación densamente llena de bacterias para ayudar en la extracción de nutrientes19,20. Finalmente, la naturaleza omnívora de las cucarachas permite una diversidad de regímenes de dieta que no serían posibles con los especialistas en dieta.

Las cucarachas americanas pueden ser un sistema modelo útil para comprender las comunidades microbianas intestinales en organismos superiores, pero el estado de la cucaracha como plaga también hace que este sistema sea relevante para el control de plagas21. Aprovechar el conocimiento fundamental de la influencia de la comunidad intestinal en la salud y la fisiología de las cucarachas ayuda a desarrollar nuevas técnicas para el manejo de plagas.

El objetivo de este método es esbozar una descripción completa del establecimiento y mantenimiento de cucarachas americanas gnotobióticas (Periplaneta americana), pero este protocolo podría ser utilizado para generar ninfas de cualquier cucaracha ovípara. Incluye un método para la recolección eficiente y no invasiva de ootecas maduras, y una técnica no destructiva para monitorear el estado gnotobiótico de los insectos22,23,24. Mientras que los métodos anteriores de lograr y mantener cucarachas gnotobióticas describen la colección de ootheca23,24,25,26,27,la madurez de la ooteca se interpreta en términos de señales específicas de la especie (en Blattella germanica22, 24,25),o no se describeexplícitamente 27, 28,lo que dificulta la implementación para aquellos que no están familiarizados con el sistema. Dado que el método descrito aquí utiliza ootecas caídas naturalmente, el error de eliminar los huevos prematuramente está ausente. Este protocolo contiene métodos de control de calidad tanto dependientes del cultivo como independientes del cultivo, y el método dependiente del cultivo no requiere sacrificar insectos. Finalmente, este método reúne información de múltiples estudios de cucarachas gnotobióticas para crear un protocolo integral con toda la información necesaria para lograr y mantener cucarachas gnotobióticas.

Protocol

1. Preparación de materiales Mantenimiento de cultivos de cucarachasNOTA: Hay muchas maneras de criar a estos insectos robustos. Los detalles sobre el suministro de refugio y agua pueden ser diferentes dependiendo de los materiales accesibles (es decir, cartones de huevos en lugar de tubos de cartón). El siguiente protocolo de esterilización funcionará para cualquier configuración de tanque de stock. Extienda suficiente ropa de cama de astilla de madera en una pecera de 37.85 L (10 galones) para cubrir el fondo del tanque con aproximadamente 1 pulgada de ropa de cama. Preparar la carcasa cortando cartón (plano) a 2 en x 4 en piezas. Inserte piezas de cartón en tubos de cartón (por ejemplo, tubos de papel higiénico) y apile tubos en un extremo del tanque(Figura 1). Unte una capa delgada de vaselina en las dos pulgadas superiores del interior del tanque para evitar el escape de insectos.NOTA: Asegúrese de recubrir correctamente el interior de las esquinas del tanque. Agregue cucarachas transfiriendo tubos de cartón (ocupados) de un tanque de stock anterior, sacudiéndolos para liberar a sus habitantes. Para cada transferencia, mueva 100-200 cucarachas de edades mixtas y sexos mixtos. Agregue comida para perros (20-30 piezas), controle la cantidad de comida para perros en el tanque y vuelva a llenar cuando esté baja. Montar un plato de agua. Llene un pequeño recipiente de plástico reutilizable con agua de doble destilación (ddH2O). Corte las esponjas de celulosa y los agujeros en la tapa del recipiente de alimentos aproximadamente del mismo tamaño.NOTA: Las esponjas de celulosa evitan que las cucarachas se ahoguen en el plato de agua. Inserte las esponjas en los agujeros de la tapa y coloque la tapa en el recipiente lleno. Coloque el contenedor en el tanque y vuelva a llenarlo cuando esté bajo. Cubra el tanque con un paño de algodón y colóquelo en su lugar con una banda elástica. A medida que los tanques comienzan a acumular cantidades excesivas de cadáveres de frass e insectos, configure nuevos tanques y transfiera cucarachas.NOTA: Los tanques normalmente se transfieren cada 6 meses. Todas las cucarachas/huevos restantes en tanques de stock desmantelados son eutanasiados por congelación a -20 °C durante 1 h y el contenido del tanque de stock se transfiere a una bolsa de autoclave y se autoclava (1 h, ciclo de gravedad) antes de su eliminación. Los tanques de stock se esterilizan con un 2% de lejía entre usos. Desinfectar un recipiente secundario.NOTA: Este contenedor no incluye un filtro, sino que permite el intercambio de aire libre. Rocíe el interior de la tapa y la parte inferior con 2% de lejía y déjelos remojar durante 10 minutos. Limpie la lejía con una toalla de papel limpia. Rocíe el interior de la tapa y la parte inferior con etanol al 70% y seque con una toalla de papel limpia. Substituya la tapa hasta su uso. Haga slants y frascos de BHI para incubar huevos y alojar ninfas. Prepare BHI de acuerdo con las instrucciones del paquete, agregando un 2% de agar. Hervir la solución de agar BHI hasta que se aclare. Para los slants, transfiera 5 mL de alícuotas a 18 mm x 150 mm tubos de ensayo de vidrio y tapa. Esterilizar a través de autoclave (tiempo de esterilización = 20 min, ciclo líquido). Coloque los tubos en autoclave en un ángulo de 45 ° para enfriar en slants. Una vez solidificado, refrigerar hasta su uso para evitar el secado. En el el del matraz, transferir 10 ml de alícuotas de solución de agar BHI hervida en matraces Erlenmeyer de 250 ml para cubrir completamente el fondo del matraz. Cubra el matraz con papel de aluminio y esterilice mediante autoclave (20 min, ciclo líquido). Deje que los frascos en autoclave se enfríen y refrigere hasta su uso para evitar que se sequen.NOTA: No se requiere filtro de aire para esta configuración. La cubierta de papel de aluminio es suficiente para permitir el intercambio de gases al tiempo que evita la contaminación del flujo al aire libre. Esterilizar a través de autoclave: chow de rata autoclavable roto en tamaños medios (~ 1/2 pulgada piezas) en un beaker cubierto de papel de aluminio (tiempo de esterilización = 1 h, ciclo de gravedad), ddH2O en una botella tapada (tiempo de esterilización = 20 min, ciclo líquido), y fórceps en un casto cubierto de papel de aluminio (tiempo de esterilización = 20 min, ciclo de gravedad).NOTA: No llene en exceso el casto chow rata. Los pellets se hincharán en el autoclave. Establecer un tanque de “sala de maternidad”.NOTA: Este tanque contiene los mismos materiales que los tanques de almacenamiento (tubos de cartón, platos de agua con esponjas, comida para perros, ropa de cama de astillas de madera; ver Figura 1)y debe estar vacío de cucarachas a menos que se transfiera para la recolección de ootecas (ver sección 2). Humidifique una incubadora preparando un castor lleno de solución de cloruro de sodio sobresaturado (NaCl). Preparar esta solución añadiendo 37 g de NaCl por 100 mL de ddH2O y removiendo hasta que se disuelva.NOTA: Típicamente, 500 mL de solución de sal saturada típicamente humidifica una incubadora con dimensiones de cámara de 51 cm x 46 cm x 46 cm (H x W x D) durante aproximadamente un mes antes de que se deba agregar más agua. 2. Colección de ootecas Transferir hembras (en cualquier número según corresponda para experimentos planificados) que llevan ootecas (Figura 2) desde el tanque de stock a la “sala de maternidad” mediante el uso de fórceps para mover tubos de cartón que contienen hembras grávidas. Si un tubo de cartón contiene varios insectos además de la hembra grávida, primero agite el tubo en un recipiente de plástico adicional anillado con vaselina, y luego anime al insecto objetivo a volver al tubo de cartón solo. Transferir hembras de nuevo al tanque de stock una vez que han dejado caer sus oothecae. Recupere las ootecas de la camada en el tanque con las fuerzas.NOTA: Las ootecas a menudo se dejan caer dentro de las 24 h de la hembra que se transfiere. 3. Limpieza de oothecae Agregue las ootecas a un tubo de centrífuga de 5 mL que contenga 3 mL de sulfato de dodecil sódico (SDS). Vórtice para 10 s. Repita para un segundo paso de lavado con un tubo de centrífuga que contenga SDS fresca.NOTA: Se pueden utilizar hasta cinco ootecas por cada 3 mL de SDS. Usando una delicada toallita de tareas, frote suavemente la superficie de cada ooteca para eliminar cualquier residuo. Se pueden agregar más SDS para ayudar en la limpieza a fondo. Coloque las ootecas limpiadas en un bote de pesaje hasta que esté listo para la esterilización.NOTA: El protocolo puede pausarse aquí, pero dejar las ootecas en ambientes de baja humedad durante largos períodos de tiempo (días a semanas) hará que se deshidraten y pierdan viabilidad. 4. Esterilización e incubación de ootecas Agua estéril alícuota para enjuague post-esterilización. Por cada ooteca que se esterilice, llene dos tubos centrífugos de 1,5 mL con 1 mL de agua estéril. Añadir 10 μL de concentrado (32%) solución de culata de ácido peracético a 3,2 mL de ddH2O en un tubo centrífugo de 5 mL para crear una solución al 0,1% para la esterilización. Tapar e invertir varias veces para mezclar.PRECAUCIÓN: El ácido peracético es dañino en contacto con la piel o los pulmones. Diluir en una campana extractora de humos.NOTA: Esto debe hacerse el mismo día que la esterilización. Si se diluye de antemano, la solución se descompone rápidamente y, por lo tanto, no se esteriliza correctamente. Hasta cinco ootecas limpiadas pueden esterilizarse en 3,2 mL de ácido diluido. Coloque (hasta cinco) las ootecas limpiadas en la solución de ácido peracético al 0,1% durante 5 min. Invierta el tubo varias veces cada 60 s. En una campana de flujo laminar, utilice pinzas estériles para transferir cada prótesis a su propio tubo de centrífuga con agua de enjuague estéril alícuota (paso 4.1). Invertir varias veces para mezclar. Repita para un segundo enjuague, luego transfiera cada prótesis enjuagada a su propia inclinación BHI usando pinzas estériles. Coloque los slants en el recipiente secundario esterilizado. Mueva el recipiente a la incubadora humidificada a 30 °C durante 4−5 semanas hasta que eclosione.NOTA: Los slants pueden mantenerse en posición vertical por un pequeño estante de tubo de ensayo o un beaker mediano/pequeño. Revise los slants regularmente (1−2x por semana). Si aparece un crecimiento de colonias fúngicas o bacterianas en el agar, retire la inclinación contaminada. Cuando se acerque el punto de tiempo de cuatro semanas, compruebe los slants todos los días.NOTA: Una vez eclosionadas, las ninfas pueden sobrevivir hasta varias semanas solo con BHI, pero no crecerán de manera óptima. 5. Mantenimiento de ninfas gnotobióticas En una campana de flujo laminar, transferir asépticamente un pellet de chow de rata esterilizado a un matraz de BHI preparado (a partir del paso 1.3.3) con fórceps estériles. Como comprobación de esterilidad, colocar el matraz en el recipiente secundario en una incubadora de 30 °C durante 24 h, y no utilizar si aparece crecimiento. Agregue ninfas al matraz de BHI con pellets de alimentos estériles. Agítelos de su inclinación BHI y déjelos caer en el matraz en una capucha de flujo laminar.NOTA: Las ninfas no tienen tracción en las paredes de vidrio del tubo de ensayo. Agitar el tubo para sacarlos de la inclinación y luego inclinar el tubo para permitirles deslizarse por el vidrio en el matraz es efectivo. Mientras que las ninfas se pueden transferir usando fórceps, el riesgo de lesiones fatales es alto. Ariete a las ninfas con 300 μL de agua estéril una vez por semana en una campana de flujo laminar pipeteando directamente sobre el suelo de BHI del matraz. A medida que las heces de ninfa comienzan a cubrir el piso de BHI, transfiera a un nuevo matraz de BHI, agregando el chow de rata esterilizado con 24 h de anticipación (para verificar la esterilidad) como en el paso 5.1. 6. Control de calidad de la esterilidad Retire una ninfa del matraz de BHI para sacrificarla por una comprobación de control de calidad independiente del cultivo del estado gnotobiótico a través del polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLP). Para hacer esto, vierta la ninfa en un tubo de centrífuga estéril (similar a la transferencia ninfa del paso 5.1) o coloque un aplicador de madera estéril en el matraz y espere a que una ninfa comience a subirlo, luego transfiríbalo al tubo de la centrífuga. Agregue 0.5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) a la ninfa en el tubo de la centrífuga y homogeneice con un micropestle estéril hasta que todas las piezas grandes se rompan. Vórtice bien. Extraiga el ADN del homogenado de ninfa utilizando un kit de extracción de ADN bacteriano(Tabla de Materiales) dela siguiente manera. Centrifugar la ninfa homogeneizada durante 10 min a 5.000 x g y retirar el sobrenadante. Precaliente una coctelera térmica a 37 °C. Añadir 100 μL de 1x Tris-EDTA, y vórtice para resuspend completamente el pellet. Añadir 10 μL de lisozima y mezclar, seguido de una incubación de 30 min (sin agitación) en la coctelera térmica precalentada a 37 °C. Añadir 25 mg de perlas de vidrio a las muestras, y vórtice a la velocidad máxima durante 5 min. Precaliente la coctelera térmica a 55 °C. Deje que las perlas se asienten antes de transferir el sobrenadante a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mL con 100 μL de tampón de proteinasa K y 20 μL de proteinasa K. Vórtice para mezclar a fondo. Incubar, con agitación a 600 rpm, en un agitador térmico de 55 °C durante 60 min. Centrífuga a 10.000 x g durante 2 min, y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo centrífuga de 1,5 mL. Precaliente el agitador térmico a 65 °C. Comience a precalentar el tampón de elución en un horno de hibridación de 65 °C. Añadir 220 μL de etanol al 100%. Vórtice a velocidad máxima para 20 s. Rompa cualquier precipitado visible pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10x. Inserte una columna de ADN en un tubo de recolección de 2 mL y transfiera la muestra a la columna, incluido cualquier precipitado que se haya formado. Centrífuga a 10.000 x g durante 1 min, deseche el filtrado del tubo de recolección y reemplace el tubo de recolección. Agregue 500 μL de búfer de unión a la columna y centrífuga a 10.000 x g durante 1 min. Deseche el filtrado del tubo de recolección y reemplácelo. Agregue 700 μL de tampón de lavado de ADN a la columna y centrífuga a 10,000 x g durante 1 min. Deseche el filtrado del tubo de recolección y reemplácelo. Repita para un segundo paso de lavado. Centrífuga vaciar la columna durante 2 minutos para secarla, transfiriendo la columna a un nuevo tubo centrífuga de 1,5 mL después. Añadir 50 μL de tampón de elución precalentado directamente a la matriz de la columna de ADN e incubar a 65 °C durante 5 min. Centrífuga a 10.000 x g durante 1 min a eluir. Cuantificar el ADN extraído en el filtrado mediante espectrofotometría o fluorometría. Amplificar y digerir todo el gen 16S. Visualice fragmentos usando electroforesis en gel. Utilice 12,5 μL de mezcla maestra 2x, 0,5 μL de cada cebador 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT) y 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG), 5 ng de ADN y agua de grado molecular para un volumen total de reacción de 25 μL. Ejecute el siguiente programa de termociclador: 94 °C durante 60 s; seguido de 35 ciclos de 94 °C para 30 s, 50 °C para 45 s, 68 °C para 90 s; seguido de 68 °C durante 5 min. Purificar el producto de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando un kit de purificación de ADN(Tabla de Materiales). Agregue 120 μL de tampón purificante al producto de PCR y vórtice para mezclar. Centrífuga brevemente para recoger gotitas dentro de la tapa. Inserte una columna de ADN en un tubo de recolección de 2 mL, transfiera líquido a la columna preparada y centrífuga a ≥13,000 x g durante 1 min. Deseche el filtrado y reemplace el tubo de recolección. Añadir 700 μL de tampón de lavado de ADN y centrífuga a ≥13.000 x g durante 1 min. Deseche el filtrado y reemplace el tubo de recolección. Repita para un segundo paso de lavado. Centrifugar la columna vacía durante 2 minutos para secar y transferir la columna a un nuevo tubo centrífuga de 1,5 mL. Añadir 50 μL de tampón de elución precalentado directamente a la matriz de la columna de ADN, e incubar a temperatura ambiente durante 2 min. Centrífuga a 10.000 x g durante 1 min a eluir. Cuantificar el ADN extraído en filtrado mediante espectrofotometría o fluorometría. Añadir 1 μg de producto de PCR purificado a 5 μL de tampón de digestión, 10 unidades RsaI y agua de grado molecular para un volumen total de reacción de 50 μL. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo e incubar a 37 °C durante 60 min. Separe el producto digerido mediante electroforesis en gel ejecutando 20 μL de ADN digerido en un gel de agarosa al 2%. Visualice el gel para confirmar el estado gnotobiótico.NOTA: Los insectos gnotobióticos solo deben dar lugar a bandas a 402 pb, 201 pb y un frotis de 163 a 148 pb, basado en la secuencia de ADNr 16S del endosimbionte, Blattabacterium. Cualquier banda adicional vista en el gel es indicativa de especies microbianas contaminantes. 7. Seguimiento aséptico del crecimiento ninfal Registre la longitud del cuerpo para rastrear el crecimiento de la ninfa midiendo los insectos a través del piso translúcido de BHI del matraz.NOTA: Las ninfas se pueden colocar a 4 °C durante 15 minutos para ralentizar su movimiento, lo que las hace más fáciles de medir.

Representative Results

Los tanques de almacenamiento se establecen como se muestra en la Figura 1. Las hembras “embarazadas” son identificadas por la ooteca unida al abdomen posterior, como se muestra en la Figura 2. La incubación de ootecas en el agar BHI permite el control de calidad gnotobiótico de una manera no destructiva. En algunos casos, la esterilización no tiene éxito, y el crecimiento aparece alrededor de las ootecas como en la Figura 3B. Estas ootecas deben eliminarse y desecharse. En nuestras manos, se observó una tasa de fracaso promedio del 10% para la esterilización (n = 51). Las ootecas eclosionan un promedio de 34 días después de la esterilización sin crecimiento en el medio, como se ve en la Figura 3A. Hemos observado tasas típicas de eclosión del 41% (n = 46) para las ootecas esterilizadas, no contaminadas, con un promedio de 11 ninfas por ooteca. Las ninfas más grandes se transfieren a frascos de BHI cubiertos de papel de aluminio, como en la Figura 4. La lámina evita la contaminación, y las ninfas tienen espacio para crecer. RFLP del ADNr 16S de una ninfa homogeneizada se utiliza para confirmar la situación gnotobiotic. Se ha observado que las ninfas gnotobióticas crecen a un ritmo más lento que sus contrapartes no estériles, como se representa en la Figura 5. La Figura 6 muestra los resultados de insectos gnotobióticos con éxito, así como ninfas estándar (no esterilistas). Si bien esta prueba aún no ha identificado la contaminación en ausencia de un resultado positivo de cultivo, este paso se ha llevado a cabo de forma rutinaria durante experimentos críticos para descartar la presencia de microbios sensibles al oxígeno o fastidiosos contaminantes. Se ha observado un crecimiento más lento en las cucarachas gnotobióticas en comparación con los insectos estándar / no esterilistas. Figura 1: Configuración de la cultura de stock de cucarachas.Los tubos de cartón se pueden ver apilados en el otro extremo del tanque. Tanto la comida como el agua están cerca de la parte delantera del tanque. La cubierta de tela de algodón y la banda elástica se han eliminado para la visibilidad. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura. Figura 2: Una cucaracha americana “embarazada”.La flecha indica la ooteca. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura. Figura 3: Imágenes de ninfas gnotobióticas eclosionadas con éxito y esterilizadas sin éxito en las ootecas de BHI.Oothecae fue esterilizado e incubado según lo descrito en este protocolo. (A) La falta de crecimiento microbiano en la inclinación del IMC indica que los insectos están libres de organismos cultivables. (B) Las ootecas en los slants que dan lugar a la formación de colonias deben desecharse como contaminadas. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura. Figura 4: Aparato de cría gnotobiótico.Los insectos se mantienen en frascos estériles cubiertos con una tapa de papel de aluminio para evitar la contaminación. El recipiente secundario (tapa verde) se esteriliza con blanqueador al 2% seguido de etanol al 70%. El flujo de aire no está restringido en el contenedor secundario. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura. Figura 5: Datos representativos de la tasa de crecimiento que comparan las longitudes corporales de las ninfas gnotobióticas y no esterilistas. Ambos grupos de insectos fueron alimentados con dieta de roedores en autoclave. Los insectos gnotobióticos (aquí: n = 105) se mantienen en BHI como se describe. Los insectos no esterilizados (aquí: n = 50) viven en frascos con lecho de astilla de madera en autoclave con pequeños platos para el agua. Las ninfas no esterilistas crecen a una tasa promedio de 0,059 mm/día, mientras que las ninfas gnotobióticas crecen a 0,028 mm/día (p < 0,0001). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura. Figura 6: Una imagen de gel representativa de los resultados de RFLP para el control de calidad.Los amplicons del gene Whole-16S fueron digeridos con RsaI. La DNA para la polimerización en cadena fue extraída de las ninfas homogeneizadas en 1x PBS. Los carriles de “ninfa G” corresponden a ninfas gnotobióticas, mientras que los carriles de “ninfa conv” corresponden a contrapartes convencionales no esterileñas. De acuerdo con el resumen virtual de la restricción, el endosymbiont (Blattabacterium) se espera que tenga vendas en los tamaños 402 bp, 206 bp, y 163 bp, con un borrón de transferencia de las vendas entre 163 bp y 148 bp. Un insecto gnotobiótico debe mostrar sólo el patrón de bandas de Blattabacterium. Se espera que una comunidad bacteriana mixta tenga un frotis de bandas con diferentes tamaños, etiquetados aquí como “otros fragmentos bacterianos 16S”. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.

Discussion

Otros métodos que describen la generación de cucarachas gnotobióticas no describieron la recolección de ootecas o utilizaron puntos de referencia específicos para otras especies de cucarachas para indicar cuándo las ootecas podrían eliminarse de la madre23,25,26. Originalmente, las ootecas se recogieron de la ropa de cama de astillas de madera en los tanques de almacenamiento, lo que resultó en tasas de eclosión muy bajas (~ 10%) en comparación con las ootecas no esterilizadas (47%)29. Esto es probablemente debido al hecho de que las ootecas no arrasadas se acumulan con el tiempo en la jaula común, y no hay manera de verificar la edad o viabilidad de la ooteca. La implementación del enfoque de “sala de maternidad” permite la recolección de ootecas recién depositadas de edad conocida. Esto facilita aún más la planificación experimental, ya que el investigador puede anticipar los tiempos probables de eclosión para las ootecas individuales. Otra modificación de los protocolos iniciales y publicados incluye la incubación de ootecas y ninfas en cámaras semisecadas que también contienen una solución de cloruro de sodio sobresaturada. La presencia de la solución mantiene una humedad relativa de aproximadamente el 75%30. Las ootecas se incuban rutinariamente a 30 °C, lo que se ha demostrado que minimiza el número de días requeridos para la incubación al tiempo que maximiza la viabilidad de los embriones y el número de ninfas producidas por ooteca31. Después de la eclosión, las ninfas gnotobióticas se cultivan rutinariamente en la mesa de trabajo a temperatura ambiente y temperatura ambiente de laboratorio, aunque las cámaras con humedad controlada se utilizan nuevamente para experimentos críticos. Después del establecimiento de estos cambios en la recolección e incubación de ootecas, las tasas de eclosión aumentaron a aproximadamente el 41% (n = 51), sin incluir las ootecas eliminadas debido a la contaminación. Una ruta potencial para una mayor optimización de las tasas de eclosión puede incluir la ampliación del tiempo entre la recolección de ooteca y la esterilización. La cutícula de la caja de huevos puede no estar completamente bronceada en la liberación inicial32,y por lo tanto puede ser permeable a las soluciones utilizadas durante la esterilización dentro de las 24 h de haber sido caída.

El protocolo de esterilización con ácido peracético al 0,1% fue adaptado de Doll et al.25. Otros estudios han documentado técnicas alternativas para esterilizar las ootecas23,26. Las tasas de contaminación se basan en el método no destructivo de incubación de las ootecas en una inclinación de BHI. Este enfoque es muy ventajoso, ya que permite una rápida identificación y eliminación de las ootecas contaminadas. La mayoría de los protocolos anteriores prueban para organismos cultivables mediante el revestimiento de heces o ninfas homogeneadas en medios bacteriológicos y la comprobación del crecimiento22,23,25,27,28,33. En al menos un caso, el método para probar el estado gnotobiótico no fue completamente descrito26. Excepto Clayton que añadió una pequeña losa de medio de prueba de esterilidad a las botellas de cría24,los métodos anteriores22,23 alojaron insectos gnotobióticos en medios bacteriológicos solo por períodos cortos de tiempo para evaluar inicialmente el protocolo de esterilización.

El alojamiento continuo de las ninfas resultantes en el medio BHI como medida de control de calidad incorporada permite monitorear su estado gnotobiótico en tiempo semi-real, una técnica no vista en la mayoría de los métodos anteriores22,23. Esto es especialmente útil para experimentos a largo plazo que requieren ninfas gnotobióticas para ser accedidas. Si el suelo de IMC debajo de las ninfas aparece contaminado con crecimiento bacteriano o fúngico, el matraz debe ser desechado. Este tipo de contaminación ocurre típicamente al descubrir los frascos para regar ninfas, pero también puede surgir de las heces en el caso de ootecas o alimentos insuficientemente esterilizados. El uso de una campana de flujo laminar al regar mejora la tasa de contaminación causada por el destape de frascos.

Como no todos los organismos contaminantes pueden crecer aeróbicamente en el medio BHI, se requiere un método adicional independiente del cultivo de pruebas de esterilidad. Un enfoque potencial es la microscopía27,pero este enfoque puede ser intensivo en mano de obra. Otros protocolos utilizan técnicas basadas en secuencias para detectar organismos que pueden escapar del cultivo14,23,27,28. Sin embargo, estos enfoques son a menudo costosos y difíciles de interpretar, ya que los resultados de los enfoques de secuenciación de alto rendimiento pueden verse fácilmente afectados por la contaminación de bajo nivel de los reactivos34 y el salto de códigos de barras35. En su lugar, se ha desarrollado un nuevo enfoque que utiliza la amplificación por PCR del gen 16S rRNA en combinación con polimorfismo de longitud de fragmento de restricción para visualizar tanto el endosimbionte como cualquier simbionte intestinal contaminante. Esta técnica incluye un control interno de PCR, ya que el gen 16S de Blattabacteriumha sido secuenciado, y su patrón de bandas debe estar presente tanto en insectos gnotobióticos como no esterilizadores. Como el patrón de restricción del endosimbionte se puede predecir a partir de su secuencia del genoma36,no hay necesidad de secuenciar los amplicones o los fragmentos de restricción, a menos que se desee la identificación de cualquier contaminante. La versión actual de este protocolo pide que una ninfa sea sacrificada para PCR/RFLP, pero esta técnica se podría también utilizar en heces como medida no destructiva. Sin embargo, no incluirá un control incorporado, ya que las heces no deben contener mucho Blattabacterium.

Un componente adicional fácilmente modificable pero crítico de la cría de animales gnotobióticos es la dieta. Si bien el agar BHI puede servir como una fuente temporal de alimento para los insectos, se ha encontrado que resulta en déficits de crecimiento sustanciales entre las ninfas cuando se usa como única fuente de alimento durante períodos prolongados. Mientras que las dietas diversas se han probado, el chow autoclavable de la rata se recomienda como dieta rutinaria para el mantenimiento de insectos gnotobiotic. Las dietas no formuladas específicamente para la esterilización eran a menudo difíciles de hacer completamente estériles, y muchas dietas estériles o autoclavables del animal de laboratorio fueron encontradas para exhibir crecimiento fungicida rápido bajo condiciones nonsterile. Esta tendencia a degradarse en condiciones no esterilizadas los hizo inadecuados para su uso en experimentos que comparaban directamente insectos gnotobióticos y no gnotobióticos. La dieta recomendada permite el uso de una dieta consistente entre las ninfas gnotobióticas y estándar, lo que facilita la comparación de características, como las tasas de crecimiento, entre los dos grupos.

Como otros han observado27,las ninfas gnotobióticas crecen más lentamente que sus contrapartes no esterileñas. Una comparación entre las longitudes corporales de las ninfas gnotobióticas (n = 105) y no esterilistas (n = 50) alimentadas con la misma dieta de roedores en autoclave y mantenidas a temperatura ambiente revela que las ninfas no esterilistas crecen un promedio de 0,059 mm/día, mientras que las ninfas gnotobióticas crecen 0,028 mm/día (p < 0,0001) (Figura 5). Se ha demostrado que la presencia de microbiota intestinal en P. americana altera la tasa metabólica de los insectos37,y se cree que las comunidades intestinales en general afectan la absorción de nutrientes38,39. Estas razones apoyan las diferencias observadas en la tasa de crecimiento de ninfas gnotobióticas y no esterilistas.

Una posible limitación a esta técnica es que las ninfas gnotobióticas pueden no alcanzar la madurez sexual, ya que las cohortes estériles más antiguas tienen más de 10 meses de edad y han alcanzado sólo el séptimo estadio (de 10; 11 siendo la edad adulta) según la aproximación por la longitud corporal40. Estas cohortes más viejas no están en la dieta autoclavada de la rata pero en lugar de otro comen el chow irradiado de la rata, una dieta que contenga demasiada humedad para alimentar a las cohortes no esterilíes sin crecimiento excesivo del molde. Se encontró que las ninfas no esterilizadas en una dieta de alimentos para perros no esterilizados alcanzaron la edad adulta después de 9-10 meses en condiciones de laboratorio (temperatura ambiente y humedad). Las cohortes de ninfas gnotobióticas y no esterilistas en el chow compartido de ratas en autoclave tienen actualmente menos de 7 meses de edad, se estima que los insectos no esterilizadores son de séptimo estadio (promedio: 16,7 mm), mientras que los insectos estériles se estiman en quinto estadio (promedio: 11,2 mm). Como resultado, no podemos, hasta el momento, verificar si nuestras cucarachas gnotobióticas pueden reproducirse con éxito. Sin embargo, dada la facilidad con la que se pueden establecer nuevas cohortes gnotobióticas utilizando este enfoque, este método muestra una gran promesa incluso en ausencia de reproducción probada de insectos gnotobióticos.

En conclusión, este protocolo proporciona una herramienta versátil que permite a los investigadores del microbioma operar su propia “instalación” gnotobiótica de bajo costo utilizando materiales de laboratorio comunes. Este enfoque puede ser utilizado para generar cucarachas gnotobióticas para experimentos que examinen el papel de la microbiota en la conformación del comportamiento del huésped, la inmunidad, el desarrollo y las respuestasal estrés 21,26,27. Estos insectos gnotobióticos también pueden ser inoculados con comunidades sintéticas o xenobióticas y posteriormente utilizados como sujetos para estudios de microbioma intestinal23,28. Además, los elementos de este enfoque, incluido el uso de cámaras de incubación bacteriológicas forradas de medios como un control de esterilidad incorporado, son generalizables a otros sistemas modelo y pueden facilitar el mantenimiento rutinario de animales gnotobióticos en instalaciones a menor escala.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio R35GM133789. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente la opinión oficial de los Institutos Nacionales de Salud. A los autores les gustaría reconocer a Josey Dyer por rastrear las tasas de esterilización, las tasas de eclosión y las tasas de crecimiento de las cucarachas gnotobióticas.

Materials

2X master mix New England BioLabs M0482 OneTaq MasterMix
Autoclavable rat chow Zeigler NIH-31 Modified Auto
Bacterial DNA extraction kit Omega Bio-Tek D-3350 E.Z.N.A. Bacterial DNA kit; includes lysozyme, glass beads, proteinase K, buffers (proteinase K, binding, wash, elution), DNA columns, 2-mL collection tube
binding buffer Omega Bio-Tek PD099 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("HBC" buffer)
brain-heart infusion (BHI) broth Research Products International B11000
Delicate task wipes KimWipe JS-KCC-34155-PK KimWipes
DNA purification kit Omega Bio-Tek D6492 E.Z.N.A. Cycle Pure kit; D6493 may also be used; includes buffers (purifying ,wash, elution)
elution buffer Omega Bio-Tek PDR048 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
glass beads Omega Bio-Tek n/a included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
Hybridization oven UVP 95-0330-01 we use a hybridization oven for preheating elution buffer, but a water bath could probably also be used
Laminar flow biological safety cabinet NuAire, Inc. NU-425-400 Protocol refers to this as "laminar flow hood" for brevity
lysozyme Omega Bio-Tek n/a included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit
peracetic acid stock solution (32%) Sigma-Aldrich 269336
Petroleum jelly Vaseline n/a
proteinase K buffer Omega Bio-Tek PD061 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("TL buffer")
purifying buffer Omega Bio-Tek PDR042 included in Omega Biotek's CyclePure kit ("CP" buffer)
RsaI New England BioLabs R0167 Includes CutSmart (digestion) buffer
Secondary container n/a n/a a plastic container with a lid (such as a Kritter Keeper) works well for this (25cm long x 15cm wide x 22cm high); it should be large enough to fit BHI slants and test tubes
spectrophotometer ThermoFisher ND-2000 Catalog info is for NanoDrop2000
thermal shaker Eppendorf EP5386000028 Thermomixer R
Tris-EDTA Fisher BP1338-1 10 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8
wash buffer Omega Bio-Tek PDR044 included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("DNA wash" buffer)
Woodchip bedding P.J. Murphy Forest Products Sani-Chips
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Dukes, H. E., Dyer, J. E., Ottesen, E. A. Establishment and Maintenance of Gnotobiotic American Cockroaches (Periplaneta americana). J. Vis. Exp. (171), e61316, doi:10.3791/61316 (2021).
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