グノトビオティック・アメリカン・ゴキブリの設立と維持 (ペリプラネタ・アメリカーナ)

1. 材料の準備 ストックゴキブリ文化の維持注:これらの堅牢な昆虫を飼育する多くの方法があります。避難所と水を提供する際の詳細は、アクセス可能な材料(すなわち、段ボールチューブの代わりに卵のカートン)によって異なる場合があります。次の滅菌プロトコルは、任意のストックタンクのセットアップに対して動作します。 37.85 L (10 ガロン) の魚のタンクに十分なウッドチップの寝具を広げて、約 1 インチの寝具でタンクの底を覆います。(平らな)段ボールを2分の4に切って住宅を準備します。段ボールの管(例えば、トイレットペーパーチューブ)とタンクの一端に積み重ね管に段ボール片を挿入する(図1)。 昆虫の脱出を防ぐために、タンクの内側の上2インチに石油ゼリーの薄い層を塗ります。注:タンクの角の内側を適切にコーティングしてください。 以前のストックタンクから(占有された)段ボールチューブを転送してゴキブリを追加し、住民を解放するためにそれらを振ります。各転送のために、100-200混合年齢、混合セックスゴキブリを移動します。ドッグフード(20~30個)を加え、タンク内のドッグフードの量を監視し、低いときに補充します。 水皿をセットする。 小さなプラスチック製の再利用可能な食品容器に二重蒸留水(ddH2O)を充填します。食品容器の蓋にセルローススポンジと穴をほぼ同じ大きさに切ります。注:セルローススポンジは、ゴキブリが水皿に溺れるのを防ぎます。 蓋の穴にスポンジを挿入し、充填された容器の上に蓋を置きます。容器をタンクに入れ、低い時に補充します。綿布でタンクを覆い、弾性バンドで所定の位置に固定します。 タンクが過剰な量のフレームや昆虫の死骸を蓄積し始めると、新しいタンクを設置し、ゴキブリを移送します。注:タンクは通常6ヶ月ごとに転送されます。廃炉ストックタンク内の残りのゴキブリ/卵は、1時間-20°Cで凍結することによって安楽死させられ、ストックタンクの内容物は、その後、オートクレーブバッグに移され、処分前にオートクレーブ(1時間、重力サイクル)に移されます。ストックタンクは、使用間に2%の漂白剤で滅菌されます。 二次容器を消毒する。注:このコンテナにはフィルタは含まれていませんが、代わりに無料の空気交換が可能です。 蓋と底の両方の内側に2%の漂白剤をスプレーし、10分間浸します。きれいなペーパータオルで漂白剤を拭き取ります。 蓋の内側と底部に70%のエタノールをスプレーし、清潔なペーパータオルで拭きます。使用するまで蓋を交換してください。 卵や住宅のニンフをインキュベートするためのBHIスラントとフラスコを作ります。 パッケージの指示に従ってBHIを準備し、2%寒天を追加します。明確になるまでBHI-寒天溶液を沸騰させます。 スラントの場合は、5 mLアリコートを18 mm x 150 mmガラス試験管とキャップに移します。オートクレーブ(滅菌時間=20分、液体サイクル)を介して滅菌します。45°の角度でオートクレーブチューブを置き、スラントに冷却します。固めたら、乾燥を防ぐために使用するまで冷蔵する。 フラスコの場合、煮たBHI寒天溶液の10 mLアリコートを250 mLのエルレンマイヤーフラスコに移し、フラスコの底部を完全に覆います。フラスコをホイルで覆い、オートクレーブ(20分、液体サイクル)で滅菌します。オートクレーブフラスコを冷却し、乾燥を防ぐために使用するまで冷蔵します。注: このセットアップにはエアフィルタは必要ありません。ホイルカバーは、オープンエアフローからの汚染を防止しながらガス交換を可能にするのに十分です。 オートクレーブを介して殺菌:ホイルで覆われたビーカー(滅菌時間= 1時間、重力サイクル)で半サイズ(約1/2インチ)に分割されたオートクレーブ可能なラットチャウ、キャップボトルのddH2O(滅菌時間= 20分、液体サイクル)、およびホイルで覆われたビーカーの鉗子(滅菌時間= 20分、重力サイクル)。注:ラットチャウビーカーをオーバーフィルしないでください。ペレットはオートクレーブで膨らむ。 「産科病棟」タンクを設置する。注:このタンクにはストックタンク(段ボールチューブ、スポンジ付きの水皿、ドッグフード、ウッドチップ寝具、 図1参照)と同じ材料が含まれており、oothecaeコレクションのために転送されない限り、ゴキブリは空でなければなりません(セクション2参照)。 過飽和塩化ナトリウム(NaCl)溶液を満たしたビーカーを調製して、インキュベーターを加湿します。この溶液を調製し、DDH2Oの100mLあたり37gのNaClを加え、溶解するまで撹拌します。注:通常、500 mLの飽和塩溶液は、通常、チャンバー寸法51cm x 46 cm x 46 cm(H x W x D)を加える前に、約1ヶ月間、培養器を湿気させます。 2. オテカエのコレクション ウーテカイ(図2)を運ぶ女性(計画実験に応じて任意の数)をストックタンクから「産科病棟」に移し、鉗子を使用して、グラビドメスを含む段ボールチューブを移動します。 車のチューブにグラビドメスに加えて複数の昆虫が含まれている場合は、まずチューブを振り出して石油ゼリーで鳴らされた追加のプラスチック容器に入れ、次にターゲット昆虫が一人で段ボールチューブに戻るように促します。 彼らは彼らのオテカイを落とした後、ストックタンクに戻って女性を転送します。鉗子でタンク内のごみからオテカエを取り出します。注:オテカエは、多くの場合、転送されている女性の24時間以内にドロップされます。 3. オテカエの洗浄 3 mLのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む5mL遠心分離管にオテカエを加えます。10 sのための渦。新鮮なSDSを含む遠心管で2回目の洗浄ステップを繰り返します。注:SDSの3 mLあたり最大5つのオテカエを使用することができます。 繊細な作業ワイプを使用して、各オテカの表面を静かにこすって破片を取り除きます。徹底的なクリーニングを支援するために、より多くのSDSを追加することができます。洗浄されたオテカエを計量艇に入れ、殺菌の準備が整うまで置きます。注: プロトコルはここで一時停止する場合がありますが、oothecae を長期間(数日から数週間)低湿度環境に放置すると、脱水症状が発生し、生存率が失われます。 4. オテカエの殺菌とインキュベーション 滅菌後の水のアリコート滅菌水滅菌されるすべてのオテカのために、滅菌水の1 mLで2つの1.5 mL遠心分離管を充填します。 濃縮物を10μL加える(32%)5 mL 遠心分離管内の 3.2 mL の ddH2O に対する過酢酸ストック溶液を、殺菌用の 0.1% 溶液を作成します。キャップと反転を数回混合します。注意:過酢酸は皮膚や肺と接触して有害です。ヒュームフードで希釈します。注:これは、殺菌と同じ日に行う必要があります。あらかじめ希釈すると、溶液はすぐに分解され、適切に殺菌されません。5個もの洗浄済みオテカエを3.2mLの希酸で滅菌することができる。 0.1%の過酢酸溶液に(最大5個)洗浄したオテカエを5分間入れます。チューブを60sごとに数回反転します。 層流フードでは、滅菌鉗子を使用して、各オテカを、分け入れ菌リンス水を入れて独自の遠心管に移します(ステップ4.1)。ミックスするために数回反転します。2回目のすすいで繰り返し、滅菌鉗子を使用してそれぞれのリンスオテカを独自のBHI傾斜に移します。 滅菌された二次容器にスラントを入れます。孵化するまで4〜5週間、30°Cの加湿インキュベーターに容器を移動します。注:スラントは、小さな試験管ラックまたは中小ビーカーによって直立して保持することができます。 スラントを定期的に確認します(週1-2倍)。寒天に真菌または細菌コロニーの成長が現れた場合は、汚染された傾斜を取り除きます。4週間のタイムポイントが近づくと、毎日スラントをチェックしてください。注:一度孵化すると、ニンフはBHIだけで数週間まで生き残ることができますが、最適に成長しません。 5. グノトビオティックニンフのメンテナンス 層流フードでは、無菌鉗子で調製されたBHIフラスコ(ステップ1.3.3から)に殺菌されたラットチャウのペレットを無菌的に移す。滅菌性チェックとして、フラスコを24時間30°Cインキュベーターの二次容器に入れ、増殖が現れる場合は使用しないでください。 無菌食品ペレットでBHIフラスコにニンフを加えます。BHIの傾斜からそれらを振り、彼らはラミナーフローフードでフラスコに落ちてみましょう。注:ニンフは試験管のガラス壁に牽引力を持っていません。チューブを振って傾斜部分からノックオフし、チューブを傾け、ガラスをフラスコに滑り込まさせるのが効果的です。ニンフは鉗子を使って移すことができるが、致命的な傷害のリスクは高い。 フラスコのBHI床に直接ピペットを入れ、ラミナーフローフードで週に1回300 μLの無菌水を水にします。 ニンフフェックがBHI床を覆い始めると、新しいBHIフラスコに移し、ステップ5.1のように(滅菌を検証するために)事前に殺菌されたラットチャウ24時間を加える。 6. 無菌の品質管理 制限フラグメント長ポリモーフィズム(RFLP)を介してグノトビオティック状態の培養に依存しない品質管理チェックのために犠牲にするためにBHIフラスコから1つのニンフを取り除きます。これを行うには、無菌遠心分離管(ステップ5.1からのニンフの移動に似ています)にニンフを注ぐか、無菌木製アプリケーターをフラスコに入れ、ニンフが登り始めるのを待ってから遠心分離管に移します。 遠心管のニンフに0.5mのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加え、すべての大きな部分が分解されるまで無菌マイクロペステスルで均質化します。渦はよく。 細菌DNA抽出キット(材料表)を用いて、ニンフホモジネートからDNAを抽出します。 5,000 x g で10分間均質化されたニンフを遠心分離し、上清を取り除きます。サーマルシェーカーを37°Cに予熱します。 1x Tris-EDTAを100 μL、渦を加え、ペレットを完全に再懸濁します。10 μLのリソチームを加えて混ぜ、次に予熱した37°Cサーマルシェーカーで30分(揺れなし)インキュベーションを行います。 サンプルに25mgのガラスビーズを加え、最大速度で5分間渦を加えます。サーマルシェーカーを55°Cに予熱します。 100 μL のプロテナーゼ K バッファーと 20 μL のプロテナーゼ K. ボルテックスを使用して新しい 1.5 mL 遠心分離管に上清を移す前にビーズを落ち着かせるようにします。 インキュベートは、600rpmで振盪し、55°Cのサーマルシェーカーで60分間行う。2分間10,000xgで遠心分離機、上清を新しい1.5 mL遠心管に移します。サーマルシェーカーを65°Cに予熱します。 溶出バッファーを 65 °C ハイブリダイゼーションオーブンで予熱します。 220 μLのエタノールを100%加えます。20 sの最高速度で渦。10倍上下にピペットを入れて、目に見える沈殿物を分解します。 DNAカラムを2mLの採取チューブに挿入し、形成した可能性のある任意の沈殿物を含むカラムにサンプルを移す。10,000 x g で1分間遠心分離機を、回収管から濾液を捨てて、回収管を交換してください。 500 μL の結合バッファーをカラムに加え、遠心分離機を 10,000 x g で 1 分間追加します。コレクションチューブから濾液を捨て、回収管を交換してください。 カラムに700μLのDNA洗浄バッファーを加え、遠心分離機を10,000 x g で1分間追加します。コレクションチューブから濾液を捨て、回収管を交換してください。2回目の洗浄手順を繰り返します。 遠心分離機空柱を2分間乾燥させ、その後新しい1.5 mL遠心分離管に移した。50 μLの予熱溶出バッファーをDNAカラムマトリックスに直接加え、65°Cで5分間インキュベートします。 10,000 x g で遠心分離機を1分間に溶出する。分光光度測定またはフルオロメトリーを介して濾液中の抽出DNAを定量化する。 16S遺伝子全体を増幅して消化する。ゲル電気泳動を用いてフラグメントを可視化する。 2xマスターミックスの12.5 μL、各プライマー1492R(5′-GGTTACCTGTTACGACTT)および27F(5′-AGAGTTTTGTCCGGCTCTCAG)、5 ngのDNA、および分子グレードの水を使用して25μLの総反応量を達成します。 次のサーモサイクラープログラムを実行します: 60 sのための94 °C;続いて、30 sの94°Cの35サイクル、45sの50°C、90sのための68°Cが続きます。68°Cを5分間続く。 DNA精製キット(材料表)を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)製品を精製する。 PCR産物に120μLの精製バッファーを加え、混合する渦を加えます。蓋の中に液滴を集めるために簡単に遠心分離機。DNAカラムを2mLの回収チューブに挿入し、調製したカラムに液体を移し、13,000 x g で1分間遠心分離機≥。 濾液を捨てて、回収管を交換してください。700 μL の DNA 洗浄バッファーと遠心分離機を ≥13,000 x g で 1 分間追加します。濾液を捨てて、回収管を交換してください。2回目の洗浄手順を繰り返します。 2分間空の柱を乾燥させて新しい1.5 mL遠心管に移します。50 μLの予熱溶出バッファーをDNAカラムマトリックスに直接加え、室温で2分間インキュベートします。 10,000 x g で遠心分離機を1分間に溶出する。分光光度測定またはフルオロメトリーを介して濾液中の抽出DNAを定量化する。 精製PCR産物1μgを5μLの消化バッファー、10単位のRsaI、分子グレードの水に加え、総反応量50μLに加え、37°Cで60分間インキュベートします。 2%アガロースゲル上で20μLの消化DNAを実行することにより、ゲル電気泳動で消化された製品を分離します。ゲルを視覚化して、グノトビオティックの状態を確認します。注:グノトビオティック昆虫は、402 bp、201 bp、および163〜148bpのスミアのバンドを、endosymbiont、 ブラタバクテリウムの16S rDNA配列に基づいてのみ生じるべきである。ゲルに見られる余分なバンドは、微生物種を汚染していることを示しています。 7. ニンフガルの成長の無菌追跡 フラスコの半透明のBHI床を通して昆虫を測定することによってニンフルの成長を追跡するために体長を記録する。注:ニンフは、動きを遅くするために4°Cに15分間置き、測定しやすくすることができます。