Ensayo no radioactivo para medir la fosforilación de polinucleótido de sustratos de nucleótidos pequeños
Summary
Este protocolo describe un ensayo no radioactivo para medir la actividad quinasa de las quinasas de polinucleótidos (PNK) en sustratos pequeños de ADN y ARN.
Abstract
Las quinasas de polinucleótidos (PNK) son enzimas que catalizan la fosforilación del extremo hidroxilo de 5′ del ADN y los oligonucleótidos de ARN. La actividad de los PNK se puede cuantificar mediante enfoques directos o indirectos. Aquí se presenta un enfoque directo e in vitro para medir la actividad de PNK que se basa en un sustrato de oligonucleótido con etiqueta fluorescente y electroforesis de gel de poliacrilamida. Este enfoque proporciona la resolución de los productos fosforilados evitando el uso de sustratos radiomarcados. El protocolo detalla cómo configurar la reacción de fosforilación, preparar y ejecutar grandes geles de poliacrilamida, y cuantificar los productos de reacción. La parte técnicamente más difícil de este ensayo es verter y ejecutar los grandes geles de poliacrilamida; por lo tanto, se proporcionan detalles importantes para superar las dificultades comunes. Este protocolo fue optimizado para Grc3, un PNK que se ensambla en un complejo de procesamiento de ARN pre-ribosomal obligado con su socio de unión, la nucleasa Las1. Sin embargo, este protocolo se puede adaptar para medir la actividad de otras enzimas PNK. Además, este ensayo también se puede modificar para determinar los efectos de diferentes componentes de la reacción, como el trifosfato de nucleósidos, iones metálicos y oligonucleótidos.
Introduction
Las quinasas polinucleótidas (PNK) desempeñan un papel fundamental en muchas vías de procesamiento de ADN y ARN, como la reparación del ADN y el ensamblaje ribosoma1,,2,,3,,4,,5. Estas enzimas fundamentales catalizan la transferencia del monofosfato terminal (gamma) de un trifosfato de nucleósido (NTP, más a menudo ATP) al extremo hidroxilo de 5′ de un sustrato de nucleótido. Uno de los PNK más caracterizados es el bacteriófago T4 PNK, que tiene una amplia especificidad de sustrato y es muy utilizado por los laboratorios de biología molecular para la incorporación de etiquetas de isótopos radiactivos en el 5 terminus de un sustrato de ADN o ARN6,7,8,9,10,11,12. Otro ejemplo de una enzima PNK es CLP1, que se encuentra en Eukarya, Eubacteria y Archaea, y está implicado en varias vías de procesamiento de ARN4,13,14,15.
Históricamente, la mayoría de los ensayos que miden la actividad de polinucleótido quinasa dependen del etiquetado de isótopos radiactivos y de la posterior autoradiografía5,,16. En los últimos años se han desarrollado una serie de ensayos adicionales para medir la actividad de PNK, incluyendo enfoques de molécula única, electroforesis de microchip, balizas moleculares, así como ensayos colorimétricos y basados en luminiscencia17,18,19,20,21,22. Si bien muchos de estos nuevos enfoques proporcionan límites de detección mejorados y evitan el uso de radiactividad, cada uno tiene inconvenientes, como el costo, la dependencia de la resina inmovilizada y las limitaciones en la elección del sustrato.
Grc3 es un polinucleótido quinasa que desempeña un papel fundamental en el procesamiento de ARN pre-ribosomal2,3,23. Grc3 forma un complejo obligado con la endoribonucleasa Las1, que corta el Espaciador Transcrito Interno 2 (ITS2) del ARN pre-ribosomal3. Cleavage del ITS2 de Las1 genera un producto que alberga un hidroxilo de 5′ que posteriormente es fosforilado por la Grc3 quinasa3. Para investigar la especificidad de nucleótidos y sustratos de Grc3, se requirió un ensayo barato que permitió realizar pruebas de diferentes sustratos de oligonucleótidos. Por lo tanto, se desarrolló un ensayo de fosforilación PNK utilizando sustratos con etiqueta fluorescente. Este ensayo se utilizó con éxito para determinar que Grc3 puede utilizar cualquier NTP para la actividad de transferencia de fósforo, pero favorece ATP24. Este protocolo adapta el ensayo original para medir la actividad PNK de Grc3 en una imitación de ARN de su sustrato de ARN pre-ribosomal (SC-ITS2, Tabla 1). Un aspecto desafiante de este enfoque basado en la fluorescencia es la dependencia de grandes geles de poliacrilamida para resolver eficazmente los sustratos fosforilados y no fosforilados. El protocolo proporciona detalles específicos sobre cómo verter estos geles grandes y evitar escollos comunes al hacerlo.
Trabajar con ARN requiere un cuidado especial porque es muy susceptible a la degradación. Hay medidas preventivas simples que uno puede tomar para limitar la contaminación por ribonucleasa. Una estación de trabajo de ARN independiente que se puede tratar fácilmente con un agente limpiador que contiene inhibidores de la ARNa a menudo es útil. Es necesario usar siempre guantes cuando se manejen muestras y se utilicen consumibles certificados sin RNase. Debido a que el agua es otra fuente común de contaminación, lo mejor es utilizar agua recién purificada y esterilizar todas las soluciones utilizando un filtro de 0,22 m.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se describe un ensayo para medir la actividad quinasa de Grc3 PNK en sustratos de nucleótidos con etiqueta fluorescente. Este protocolo se puede aplicar para caracterizar otras enzimas PNK adaptando el búfer de reacción y el sustrato de oligonucleótido. Por ejemplo, el protocolo requiere una cantidad de seguimiento de EDTA. La adición de EDTA es beneficiosa por dos razones: En primer lugar, este enfoque favorece grc3 unido al magnesio al impedir que la enzima se une a cantidades traza de metales contaminantes en la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Andrew Sikkema y Andrea Kaminski por su lectura crítica de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramuros del Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos; Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental de los Estados Unidos (NIEHS; ZIA ES103247 a R.E.S) y los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (CIHR; 146626 a M.C.P).
Materials
| 0.4 mm 34-well comb | BioRad | 1653848 | |
| 0.4 mm spacer | BioRad | 1653812 | |
| 0.5 M EDTA ph 8.0 | KD Medical | RGF-3130 | |
| 1M Magnesium Chloride | KD Medical | CAC-5290 | |
| 1M Tris pH 8.0 | KD Medical | RGF-3360 | |
| 40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 | BioRad | 1610146 | |
| 5M Sodium Chloride | KD Medical | RGF-3720 | |
| ammonium persulfate (APS) | BioRad | 161-0700 | |
| ATP | Sigma | A2383-1G | |
| boric acid | Sigma | B0394 | |
| bromophenol blue sodium salt | Sigma | B5525-5G | |
| Glass Plates | Thomas Scientific | 1188K51 | |
| Hoefer SQ3 Sequencer | Hoefer | N/A | |
| Image J Software | N/A | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Labeled RNA oligonucleotides | IDT | Custom Order | |
| Pharmacia EPS 3500 Power Supply | Pharmacia | N/A | |
| Steriflip 0. 22 um Filter | Millipore | 5FCP00525 | |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| tris base | Sigma | TRIS-RO | |
| Typhoon FLA 9500 gel imager | GE Healthcare | N/A | |
| Ultra Pure DEPC Water | Invitrogen | 750023 | |
| Ultra Pure Glycerol | Invitrogen | 19E1056865 | |
| urea | Fisher Chemical | U15-500 |
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