JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Deutsch

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Nichtradioaktiver Test zur Messung der Polynukleotid-Phosphorylierung kleiner Nukleotidsubstrate

Published: May 08, 2020
doi:
10.3791/61258
,
1Signal Transduction Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services,National Institutes of Health

Summary

Dieses Protokoll beschreibt einen nicht radioaktiven Test zur Messung der Kinaseaktivität von Polynukleotid-Kinasen (PNKs) auf kleinen DNA- und RNA-Substraten.

Abstract

Polynukleotid-Kinasen (PNKs) sind Enzyme, die die Phosphorylierung des 5′-Hydroxylendes von DNA- und RNA-Oligonukleotiden katalysieren. Die Aktivität von PNKs kann mit direkten oder indirekten Ansätzen quantifiziert werden. Hier wird ein direkter In-vitro-Ansatz zur Messung der PNK-Aktivität vorgestellt, der auf einem fluoreszierend markierten Oligonukleotidsubstrat und polyacrylamidgelelektrophorese beruht. Dieser Ansatz ermöglicht die Auflösung der phosphorylierten Produkte bei gleichzeitiger Vermeidung der Verwendung von radioaktiv markierten Substraten. Das Protokoll beschreibt, wie die Phosphorylierungsreaktion eingerichtet, große Polyacrylamid-Gele zubereitet und betrieben werden und die Reaktionsprodukte quantifiziert werden. Der technisch anspruchsvollste Teil dieses Assays ist das Gießen und Betreiben der großen Polyacrylamidgele; daher werden wichtige Details zur Überwindung gemeinsamer Schwierigkeiten bereitgestellt. Dieses Protokoll wurde für Grc3 optimiert, ein PNK, das sich mit seinem Bindungspartner, der Las1-Nuklease, zu einem obligaten präribosomalen RNA-Verarbeitungskomplex zusammensetzt. Dieses Protokoll kann jedoch angepasst werden, um die Aktivität anderer PNK-Enzyme zu messen. Darüber hinaus kann dieser Test auch modifiziert werden, um die Auswirkungen verschiedener Komponenten der Reaktion zu bestimmen, wie z. B. Nukleosidtriphosphat, Metallionen und Oligonukleotide.

Introduction

Polynukleotid-Kiinasen (PNK) spielen in vielen DNA- und RNA-Verarbeitungswegen eine entscheidende Rolle, wie z. B. DNA-Reparatur und Ribosome-Montage1,2,3,4,5. Diese grundlegenden Enzyme katalysieren die Übertragung des terminalen (Gamma)-Monophosphats von einem Nukleosidtriphosphat (NTP, am häufigsten ATP) auf das 5′ Hydroxylende eines Nukleotidsubstrats. Eines der am besten charakterisierten PNKs ist das Bakteriophagen T4 PNK, das eine breite Substratspezifität hat und von molekularbiologischen Labors stark genutzt wird, um radioaktive Isotopenetiketten auf den 5 Endpunkt eines DNA- oder RNA-Substrats6,7,8,9,10,11,12zu integrieren. Ein weiteres Beispiel für ein PNK-Enzym ist CLP1, das in Eukarya, Eubacteria und Archaea vorkommt und in mehrere RNA-Verarbeitungswege4,13,14,15verwickelt ist.

Historisch gesehen sind die meisten Assays, die die Aktivität der Polynukleotidkinase messen, von der Kennzeichnung radioaktiver Isotope und der anschließenden Autoradiographie5,16abhängig. In den letzten Jahren wurden eine Reihe zusätzlicher Assays entwickelt, um die PNK-Aktivität zu messen, darunter Einzelmolekülansätze, Mikrochip-Elektrophorese, molekulare Leuchttürme sowie kolorimetrische und lumineszenzbasierte Assays17,18,19,20,21,22. Während viele dieser neuen Ansätze verbesserte Nachweisgrenzen bieten und den Einsatz von Radioaktivität vermeiden, hat jeder Nachteile, wie Kosten, Abhängigkeit von immobilisiertem Harz und Einschränkungen bei der Substratauswahl.

Grc3 ist eine Polynukleotidkinase, die eine zentrale Rolle bei der Verarbeitung von präribosomaler RNA2,3,23spielt. Grc3 bildet einen obligaten Komplex mit der Endoribonuklease Las1, die den Internal Transcribed Spacer 2 (ITS2) der präribosomalen RNA3spaltet. Die Spaltung des ITS2 durch Las1 erzeugt ein Produkt, das ein 5′ Hydroxyl beherbergt, das anschließend von der Grc3-Kinase3phosphoryliert wird. Um die Nukleotid- und Substratspezifität von Grc3 zu untersuchen, war ein kostengünstiger Test erforderlich, der das Testen verschiedener Oligonukleotidsubstrate ermöglichte. Daher wurde ein PNK-Phosphorylierungstest mit fluoreszierend markierten Substraten entwickelt. Dieser Test wurde erfolgreich verwendet, um festzustellen, dass Grc3 jedes NTP für Phosphoryltransferaktivität nutzen kann, begünstigt aber ATP24. Dieses Protokoll passt den ursprünglichen Assay an, um die PNK-Aktivität von Grc3 auf einer RNA-Mimik seines präribosomalen RNA-Substrats zu messen (SC-ITS2, Tabelle 1). Ein herausfordernder Aspekt dieses fluoreszenzbasierten Ansatzes ist die Abhängigkeit von großen Polyacrylamid-Gelen, um phosphorylierte und nicht phosphorylierte Substrate effektiv zu lösen. Das Protokoll enthält spezifische Details darüber, wie diese großen Gele gegossen werden und dabei häufige Fallstricke vermieden werden können.

Die Arbeit mit RNA erfordert besondere Sorgfalt, da sie stark anfällig für Degradation ist. Es gibt einfache vorbeugende Schritte, um ribonuklease-Kontamination zu begrenzen. Eine separate RNA-Workstation, die leicht mit einem RNase-Inhibitor-haltigen Reinigungsmittel behandelt werden kann, ist oft hilfreich. Bei der Handhabung von Proben und der Verwendung von RNase-freien zertifizierten Verbrauchsmaterialien ist immer Handschuhe zu tragen. Da Wasser eine weitere häufige Kontaminationsquelle ist, ist es am besten, frisch gereinigtes Wasser zu verwenden und alle Lösungen mit einem 0,22 m-Filter zu sterilisieren.

Protocol

1. Vorbereitung Puffer und Reagenzien vorbereiten. Machen Sie 1x Reaktionspuffer, indem Sie 20 l von 1 M Tris (pH = 8,0), 40 l 5 m Natriumchlorid, 2,5 l 2 m Magnesiumchlorid, 100 l 50 % (v/v) Glycerin und RNase-freies Wasser kombinieren, um ein Gesamtvolumen von 1 ml zu erreichen. Harnstoff-Ladefarbstoff durch Kombination von 4,8 g Harnstoff, 200 l 1 M Tris (pH = 8,0), 20 l 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 0,5 ml 1% (w/v) Bromophenolblau und RNase-freiem Wasser für ein Gesamtvolumen von 10 ml. …

Representative Results

Abbildung 1zeigt ein erfolgreiches repräsentatives Denaturierungsgel einer Titration von ATP mit einer festen Menge an Las1-Grc3-Komplex . Die Zugabe des Enzyms führte zu einer Las1-vermittelten RNA-Spaltung des SC-ITS2-RNA-Substrats, was zu einem definierten RNA-Fragment (5-OH C2 RNA) führte. Nach Zugabe von ATP wurde das C2-RNA-Fragment durch Grc3 PNK (5-P C2 RNA) phosphoryliert. Bei der Denaturierung von Gelen wandert die phosphorylierte RNA schneller a…

Discussion

Beschrieben ist ein Test zur Messung der Kinase-Aktivität von Grc3 PNK auf fluoreszierend markierten Nukleotidsubstraten. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um andere PNK-Enzyme durch Anpassung des Reaktionspuffers und des Oligonukleotidsubstrats zu charakterisieren. Beispielsweise fordert das Protokoll eine Rückverfolgungsmenge von EDTA. Die Zugabe von EDTA ist aus zwei Gründen von Vorteil: Erstens begünstigt dieser Ansatz Magnesium-gebundene Grc3, indem verhindert wird, dass das Enzym an die Rückverfolgbarke…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Andrew Sikkema und Andrea Kaminski für ihre kritische Lektüre dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom US National Institute of Health Intramural Research Program unterstützt; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS; ZIA ES103247 an R.E.S) und die Canadian Institutes of Health Research (CIHR; 146626 bis M.C.P).

Materials

0.4 mm 34-well comb BioRad 1653848
0.4 mm spacer BioRad 1653812
0.5 M EDTA ph 8.0 KD Medical RGF-3130
1M Magnesium Chloride KD Medical CAC-5290
1M Tris pH 8.0 KD Medical RGF-3360
40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 BioRad 1610146
5M Sodium Chloride KD Medical RGF-3720
ammonium persulfate (APS) BioRad 161-0700
ATP Sigma A2383-1G
boric acid Sigma B0394
bromophenol blue sodium salt Sigma B5525-5G
Glass Plates Thomas Scientific 1188K51
Hoefer SQ3 Sequencer Hoefer N/A
Image J Software N/A N/A https://imagej.nih.gov/ij/
Labeled RNA oligonucleotides IDT Custom Order
Pharmacia EPS 3500 Power Supply Pharmacia N/A
Steriflip 0. 22 um Filter Millipore 5FCP00525
TEMED BioRad 161-0800
tris base Sigma TRIS-RO
Typhoon FLA 9500 gel imager GE Healthcare N/A
Ultra Pure DEPC Water Invitrogen 750023
Ultra Pure Glycerol Invitrogen 19E1056865
urea Fisher Chemical U15-500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
  2. Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).
  3. Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities. Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).
  4. Dikfidan, A., et al. RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1. Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).
  5. Bernstein, N. K., et al. The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase. Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).
  6. Rio, D. C. 5′-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).
  7. Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. RNA labeling, conjugation and ligation. Methods. 54 (2), 251-259 (2011).
  8. Hilario, E. End labeling procedures: an overview. Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).
  9. Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase. Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).
  10. Lillehaug, J. R., Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).
  11. Richardson, C. C. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).
  12. Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase. Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).
  13. Saito, M., et al. Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life. Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).
  14. Jain, R., Shuman, S. Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1. RNA. 15 (5), 923-931 (2009).
  15. Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).
  16. Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
  17. Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors. Talanta. 202, 317-322 (2019).
  18. Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).
  19. Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles. Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).
  20. Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme. Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).
  21. Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity. Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).
  22. Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage. Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).
  23. Castle, C. D., et al. Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).
  24. Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
  25. Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5′–>3′ exonucleases. RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).
  26. Pillon, M. C., et al. Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex. Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).
  27. Solomatin, S., Herschlag, D. Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes. Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).
  28. Giusti, W. G., Adriano, T. Synthesis and characterization of 5′-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides. PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).
  29. Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).

Tags

Polynucleotide KinasePhosphorylationDNARNASubstrateNonradioactive AssayAcrylamide GelDenaturing GelUreaTBE BufferRNA Enzyme Kinase ReactionsATP SubstrateQuenchingDownstream Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates. J. Vis. Exp. (159), e61258, doi:10.3791/61258 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image