תרגום לא רדיואקטיבי למדוד פוספורילציה פולינוקלאוטיד של מצעי נוקלאוטיד קטנים
Summary
פרוטוקול זה מתאר תסה לא רדיואקטיבית כדי למדוד פעילות קינאז של קינאז פולינוקלאוטיד (PNKs) על מצעי DNA ו RNA קטנים.
Abstract
קינאזים פולינוקלאוטידים (PNKs) הם אנזימים כי לזליז את הפוספורילציה של 5 ‘ סוף הידרוקסיל של DNA ו RNA אוליגונוקליאוטידים. ניתן לכמת את הפעילות של PNKs באמצעות גישות ישירות או עקיפות. מוצג כאן היא גישה ישירה, במבחנה כדי למדוד פעילות PNK המסתמכת על פלורסנט תיוג אוליגונוקלאוטיד ואלקטרופורזה ג’ל polyacrylamide. גישה זו מספקת רזולוציה של המוצרים זרחן תוך הימנעות משימוש ב מצעים עם תייבל רדיו. הפרוטוקול מפרט כיצד להגדיר את תגובת פוספורילציה, להכין ולהפעיל ג’לים פוליקרילאמיד גדולים, ולכימת את מוצרי התגובה. החלק המאתגר ביותר מבחינה טכנית של תס”א זה הוא לשפוך ולהריץ את ג’לים פוליקרילאמיד גדולים; לפיכך, מסופקים פרטים חשובים להתגבר על קשיים נפוצים. פרוטוקול זה היה אופטימיזציה עבור Grc3, PNK מירכב לתוך מתחם עיבוד RNA pre-ribosomal מחויב עם השותף המחייב שלה, גרעין Las1. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי למדוד את הפעילות של אנזימי PNK אחרים. יתר על כן, ניתן גם לשנות את ההתארגנות הזו כדי לקבוע את ההשפעות של רכיבים שונים של התגובה, כגון טריפוספט נוקלאוטיד, יונים מתכת, ואוליגונוקליאוטידים.
Introduction
קינאזים פולינוקלאוטידים (PNK) לשחק תפקידים קריטיים רבים DNA ו- RNA עיבוד מסלולים, כגון תיקון DNA והרכבת ריבוזום1,,2,,3,,4,,5. אנזימים בסיסיים אלה מקטנים את העברת המונופוספט של המסוף (גמא) מפרופסוף נוקלאוטיד (NTP, לרוב ATP) לקצה ההידרוקסיל של 5 אינץ’ של מלת נוקלאוטיד. אחד PNKs המאופיין היטב ביותר הוא bacteriophage T4 PNK, אשר יש ספציפיות שקוע רחב והוא מנוצל בכבדות על ידי מעבדות ביולוגיה מולקולרית לשילוב תוויות איזוטופ רדיואקטיבי על 5 מסוף של DNA או RNA בטוב6, 7,8,,,9,,10,,11,,12.8 דוגמה נוספת של אנזים PNK היא CLP1, אשר נמצא Eukarya, Eubacteria, ו Archaea, והוא מעורב במספר מסלולי עיבוד RNA4,13,14,15.
מבחינה היסטורית, רוב ההתמרמרות המודדות את פעילות הקינאז הפולינוקלאוטיד תלויות בתיוג איזוטופ רדיואקטיביובאוטוביוגרפיה הבאה 5,16. בשנים האחרונות פותחו מספר בדיקות נוספות כדי למדוד את פעילות PNK, כולל גישות מולקולה אחת, אלקטרופורזה שבב, משואות מולקולריות,כמו גם צבעיםומבוססי זוהר 17,18,19,20,21,22., בעוד שרבות מהגישות החדשות הללו מספקות מגבלות זיהוי משופרות ומומנעות משימוש ברדיואקטיביות, לכל אחת מהן יש חסרונות, כגון עלות, הסתמכות על שרף משותק ומגבלות בבחירה במצוע.
Grc3 הוא קינאז polynucleotide המי משחק תפקיד מרכזי בעיבוד של RNA טרום ריבוזומאל2,,3,,23. Grc3 מהווה קומפלקס מחייב עם ה-endoribonuclease Las1, אשר מפצל את ה-Spacer הפנימי 2 (ITS2) של ה-RNA הטרום-ריבוזומל3. מחשוף של ITS2 על ידי Las1 מייצר מוצר מחסה 5 ‘ הידרוקסיל כי הוא לאחר מכן זרחן על ידי הקינאז Grc33. כדי לחקור את הנוקלאוטיד ואת ספציפיות מצע של Grc3, תסרוקת זולה שאיפשרה בדיקה של מצעים oligonucleotide שונים נדרש. לכן, פותחה תסרוק פוספורילציה PNK באמצעות מצעים עם תווית פלורסנטית. תסיסה זו שימשה בהצלחה כדי לקבוע כי Grc3 יכול לנצל כל NTP עבור פעילות העברת פוספוריל, אבל מעדיף ATP24. פרוטוקול זה מתאים את ההסכם המקורי כדי למדוד את פעילות PNK של Grc3 על חיקוי RNA של העיבוד הטרום-ריבוזומאלי שלו RNA (SC-ITS2, טבלה 1). אחד ההיבטים המאתגרים של גישה זו מבוססת פלואורסץ הוא ההסתמכות על ג’לים פוליאקרילאמיד גדולים כדי לפתור ביעילות מצעים זרחן ולא זרחן. הפרוטוקול מספק פרטים ספציפיים על איך לשפוך ג’לים גדולים אלה ולהימנע מלכודות נפוצות בעת ביצוע פעולה זו.
עבודה עם RNA דורשת טיפול מסוים כי הוא רגיש מאוד להשפלה. ישנם צעדי מניעה פשוטים שניתן לנקוט כדי להגביל את זיהום ריבונוקלאז. תחנת עבודה נפרדת RNA שניתן לטפל בה בקלות עם חומר ניקוי המכיל מעכב RNase היא לעתים קרובות מועילה. יש צורך ללבוש כפפות תמיד בעת טיפול בדגימות ושימוש בחומרים מתכלים מאושרים ללא RNase. מכיוון שהמים הם מקור נפוץ נוסף לזיהום, עדיף להשתמש במים מטוהרים טריים ולחטא את כל הפתרונות באמצעות מסנן 0.22 μm.
Protocol
Representative Results
Discussion
מתואר הוא אזהרה כדי למדוד את פעילות kinase של Grc3 PNK על מצעי נוקלאוטיד נוקלאוטיד תיוג פלורסנט. פרוטוקול זה ניתן להחיל כדי לאפיין אנזימי PNK אחרים על ידי התאמת מאגר התגובה ומולת oligonucleotide. לדוגמה, הפרוטוקול דורש כמות מעקב של EDTA. התוספת של EDTA היא מועילה משתי סיבות: ראשית, גישה זו מעדיפה מגנזיום כבול Gr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר אנדרו סיקמה ואנדראה קמינסקי על הקריאה הביקורתית שלהם בכתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של ארה”ב למחקר פנים-עצבי; המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה בארה”ב (NIEHS; ZIA ES103247 ל-R.E.S) והכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR; 146626 ל-M.C.P).
Materials
| 0.4 mm 34-well comb | BioRad | 1653848 | |
| 0.4 mm spacer | BioRad | 1653812 | |
| 0.5 M EDTA ph 8.0 | KD Medical | RGF-3130 | |
| 1M Magnesium Chloride | KD Medical | CAC-5290 | |
| 1M Tris pH 8.0 | KD Medical | RGF-3360 | |
| 40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 | BioRad | 1610146 | |
| 5M Sodium Chloride | KD Medical | RGF-3720 | |
| ammonium persulfate (APS) | BioRad | 161-0700 | |
| ATP | Sigma | A2383-1G | |
| boric acid | Sigma | B0394 | |
| bromophenol blue sodium salt | Sigma | B5525-5G | |
| Glass Plates | Thomas Scientific | 1188K51 | |
| Hoefer SQ3 Sequencer | Hoefer | N/A | |
| Image J Software | N/A | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Labeled RNA oligonucleotides | IDT | Custom Order | |
| Pharmacia EPS 3500 Power Supply | Pharmacia | N/A | |
| Steriflip 0. 22 um Filter | Millipore | 5FCP00525 | |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| tris base | Sigma | TRIS-RO | |
| Typhoon FLA 9500 gel imager | GE Healthcare | N/A | |
| Ultra Pure DEPC Water | Invitrogen | 750023 | |
| Ultra Pure Glycerol | Invitrogen | 19E1056865 | |
| urea | Fisher Chemical | U15-500 |
References
- Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).
- Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities. Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).
- Dikfidan, A., et al. RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1. Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).
- Bernstein, N. K., et al. The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase. Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).
- Rio, D. C. 5′-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).
- Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. RNA labeling, conjugation and ligation. Methods. 54 (2), 251-259 (2011).
- Hilario, E. End labeling procedures: an overview. Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).
- Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase. Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).
- Lillehaug, J. R., Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).
- Richardson, C. C. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).
- Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase. Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).
- Saito, M., et al. Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life. Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).
- Jain, R., Shuman, S. Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1. RNA. 15 (5), 923-931 (2009).
- Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).
- Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
- Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors. Talanta. 202, 317-322 (2019).
- Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).
- Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles. Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).
- Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme. Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).
- Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity. Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).
- Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage. Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).
- Castle, C. D., et al. Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
- Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5′–>3′ exonucleases. RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).
- Pillon, M. C., et al. Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex. Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).
- Solomatin, S., Herschlag, D. Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes. Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).
- Giusti, W. G., Adriano, T. Synthesis and characterization of 5′-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides. PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).
- Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).
