Essai non radioactif pour mesurer la phosphorylation polynucléotide des petits substrats nucléotides
Summary
Ce protocole décrit un test non radioactif pour mesurer l’activité de kinase des kinases de polynucléotide (PNK) sur de petits substrats d’ADN et d’ARN.
Abstract
Les kinases polynucléotides (PNK) sont des enzymes qui catalysent la phosphorylation de l’extrémité hydroxyle de 5′ de l’ADN et des oligonucléotides d’ARN. L’activité des PNK peut être quantifiée à l’aide d’approches directes ou indirectes. Présenté ici est une approche directe et in vitro pour mesurer l’activité PNK qui repose sur un substrat oligonucléotide fluorescent et l’électrophorèse gel polyacrylamide. Cette approche permet de résoudre les produits phosphorylés tout en évitant l’utilisation de substrats radioétiquetés. Le protocole détaille comment configurer la réaction de phosphorylation, préparer et exécuter de grands gels de polyacrylamide, et quantifier les produits de réaction. La partie la plus techniquement difficile de cet essai est de verser et d’exécuter les grands gels de polyacrylamide; ainsi, des détails importants pour surmonter les difficultés communes sont fournis. Ce protocole a été optimisé pour Grc3, un PNK qui s’assemble en un complexe obligatoire de traitement de l’ARN pré-ribosomal avec son partenaire de liaison, la nucléase Las1. Cependant, ce protocole peut être adapté pour mesurer l’activité d’autres enzymes PNK. En outre, ce test peut également être modifié pour déterminer les effets de différents composants de la réaction, tels que le triphosphate nucléoside, les ions métalliques et les oligonucléotides.
Introduction
Les kinases polynucléotides (PNK) jouent un rôle critique dans de nombreuses voies de traitement de l’ADN et de l’ARN, telles que la réparation de l’ADN et l’assemblage ribosome1,2,3,4,5. Ces enzymes fondamentales catalysent le transfert du monophosphate terminal (gamma) d’un triphosphate nucléoside (NTP, le plus souvent ATP) à l’extrémité hydroxyle de 5′ d’un substrat nucléotide. L’un des PNK les plus bien caractérisés est le bactériophage T4 PNK, qui a une large spécificité de substrat et est fortement utilisé par les laboratoires de biologie moléculaire pour l’incorporation d’étiquettes d’isotopes radioactifs sur les 5 terminus d’un substrat d’ADN ou d’ARN6,7,8,9,10,11,12. Un autre exemple d’une enzyme PNK est CLP1, qui se trouve dans Eukarya, Eubactéries, et Archaea, et est impliqué dans plusieurs voies de traitement de l’ARN4,13,14,15.
Historiquement, la plupart des essais qui mesurent l’activité de la kinase polynucléotide dépendent de l’étiquetage des isotopes radioactifs et de l’autoradiographie subséquente5,16. Ces dernières années, un certain nombre d’essais supplémentaires ont été développés pour mesurer l’activité PNK, y compris les approches à molécule unique, électrophorèse micropuce, balises moléculaires, ainsi que colorimétrique et luminescence à base d’essais17,18,19,20,21,22. Bien que bon nombre de ces nouvelles approches offrent des limites de détection améliorées et évitent l’utilisation de la radioactivité, chacune présente des inconvénients, tels que le coût, la dépendance à l’égard de la résine immobilisée et des limitations dans le choix du substrat.
Grc3 est une kinase polynucléotide qui joue un rôle central dans le traitement de l’ARN pré-ribosomal2,3,23. Grc3 forme un complexe obligatoire avec l’endoribonuclease Las1, qui coupe l’Espaceur transcrit interne 2 (ITS2) de l’ARN pré-ribosomal3. Clivage de l’ITS2 par Las1 génère un produit abritant un hydroxyle de 5′ qui est ensuite phosphorylé par la kinaseGrc3 3. Pour étudier la spécificité du nucléotide et du substrat de Grc3, un test peu coûteux qui a permis l’essai de différents substrats oligonucléotides a été nécessaire. Par conséquent, un test de phosphorylation PNK utilisant des substrats fluorescents étiquetés a été développé. Cet essai a été utilisé avec succès pour déterminer que Grc3 peut utiliser n’importe quel NTP pour l’activité de transfert de phosphoryl, mais favorise ATP24. Ce protocole adapte l’essai original pour mesurer l’activité PNK de Grc3 sur un omiétisme d’ARN de son substrat d’ARN pré-ribosomal (SC-ITS2, tableau 1). Un aspect difficile de cette approche basée sur la fluorescence est la dépendance sur les grands gels de polyacrylamide pour résoudre efficacement les substrats phosphorylés et non phosphorylés. Le protocole fournit des détails spécifiques sur la façon de verser ces grands gels et d’éviter les pièges communs lors de ce faire.
Travailler avec l’ARN nécessite un soin particulier parce qu’il est fortement sensible à la dégradation. Il existe des mesures préventives simples que l’on peut prendre pour limiter la contamination par la ribonucléase. Un poste de travail d’ARN séparé qui peut être facilement traité avec un agent nettoyant contenant des inhibiteurs de RNase est souvent utile. Il est nécessaire de porter toujours des gants lors de la manipulation d’échantillons et de l’utilisation de consommables certifiés sans RNase. Comme l’eau est une autre source commune de contamination, il est préférable d’utiliser de l’eau fraîchement purifiée et de stériliser toutes les solutions à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
Protocol
Representative Results
Discussion
Décrit est un test pour mesurer l’activité de kinase de Grc3 PNK sur les substrats nucléotides fluorescents. Ce protocole peut être appliqué pour caractériser d’autres enzymes PNK en adaptant le tampon de réaction et le substrat oligonucléotide. Par exemple, le protocole nécessite une trace d’EDTA. L’ajout d’EDTA est bénéfique pour deux raisons : premièrement, cette approche favorise le Grc3 lié au magnésium en empêchant l’enzyme de se lier à des quantités infimes de métaux contaminants dans…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Andrew Sikkema et Andrea Kaminski pour leur lecture critique de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health Intramural Research Program des États-Unis; US National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS; ZIA ES103247 à R.E.S) et les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC; 146626 à M.C.P).
Materials
| 0.4 mm 34-well comb | BioRad | 1653848 | |
| 0.4 mm spacer | BioRad | 1653812 | |
| 0.5 M EDTA ph 8.0 | KD Medical | RGF-3130 | |
| 1M Magnesium Chloride | KD Medical | CAC-5290 | |
| 1M Tris pH 8.0 | KD Medical | RGF-3360 | |
| 40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 | BioRad | 1610146 | |
| 5M Sodium Chloride | KD Medical | RGF-3720 | |
| ammonium persulfate (APS) | BioRad | 161-0700 | |
| ATP | Sigma | A2383-1G | |
| boric acid | Sigma | B0394 | |
| bromophenol blue sodium salt | Sigma | B5525-5G | |
| Glass Plates | Thomas Scientific | 1188K51 | |
| Hoefer SQ3 Sequencer | Hoefer | N/A | |
| Image J Software | N/A | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Labeled RNA oligonucleotides | IDT | Custom Order | |
| Pharmacia EPS 3500 Power Supply | Pharmacia | N/A | |
| Steriflip 0. 22 um Filter | Millipore | 5FCP00525 | |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| tris base | Sigma | TRIS-RO | |
| Typhoon FLA 9500 gel imager | GE Healthcare | N/A | |
| Ultra Pure DEPC Water | Invitrogen | 750023 | |
| Ultra Pure Glycerol | Invitrogen | 19E1056865 | |
| urea | Fisher Chemical | U15-500 |
References
- Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).
- Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities. Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).
- Dikfidan, A., et al. RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1. Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).
- Bernstein, N. K., et al. The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase. Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).
- Rio, D. C. 5′-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).
- Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. RNA labeling, conjugation and ligation. Methods. 54 (2), 251-259 (2011).
- Hilario, E. End labeling procedures: an overview. Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).
- Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase. Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).
- Lillehaug, J. R., Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).
- Richardson, C. C. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).
- Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase. Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).
- Saito, M., et al. Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life. Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).
- Jain, R., Shuman, S. Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1. RNA. 15 (5), 923-931 (2009).
- Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).
- Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
- Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors. Talanta. 202, 317-322 (2019).
- Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).
- Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles. Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).
- Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme. Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).
- Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity. Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).
- Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage. Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).
- Castle, C. D., et al. Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).
- Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
- Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5′–>3′ exonucleases. RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).
- Pillon, M. C., et al. Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex. Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).
- Solomatin, S., Herschlag, D. Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes. Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).
- Giusti, W. G., Adriano, T. Synthesis and characterization of 5′-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides. PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).
- Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).
