小ヌクレオチド基質のポリヌクレオチドリン酸化を測定する非放射性アッセイ
Summary
このプロトコルは、小さなDNAおよびRNA基質上のポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)のキナーゼ活性を測定するための非放射性アッセイを記述する。
Abstract
ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)は、DNAおよびRNAオリゴヌクレオチドの5’ヒドロキシル末端のリン酸化を触媒する酵素である。PNK のアクティビティは、直接的または間接的なアプローチを使用して定量化できます。ここで提示されるPNK活性を測定するための直接的なインビトロアプローチは、蛍光標識オリゴヌクレオチド基質およびポリアクリルアミドゲル電気泳動に依存する。このアプローチは、放射性標識基材の使用を避けながら、リン酸化産物の分解能を提供します。プロトコルは、リン酸化反応を設定する方法を詳述し、大規模なポリアクリルアミドゲルを調製して実行し、反応生成物を定量化します。このアッセイの最も技術的に挑戦的な部分は、大きなポリアクリルアミドゲルを注ぎ、実行しています。したがって、共通の困難を克服するための重要な詳細が提供されます。このプロトコルは、結合パートナーであるLas1ヌクレアーゼと共に、義務的なプリリボソームRNA処理複合体に組み立てるPNKであるGrc3に最適化されました。しかし、このプロトコルは、他のPNK酵素の活性を測定するために適応することができる。また、このアッセイは、ヌクレオシド三リン酸、金属イオン、オリゴヌクレオチドなどの反応の異なる成分の影響を決定するように改変することもできる。
Introduction
ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)は、DNA修復およびリボソームアセンブリ1、2、3、4、52,3などの多くのDNAおよびRNA処理経路において重要な役割,4を5果たす。1これらの基本的な酵素は、ヌクレオシド三リン酸(NTP、最も頻繁にATP)からヌクレオ基質の5’ヒドロキシル末端への末端(γ)一リン酸の転写を触媒する。最もよく特徴づけられるPNKsの1つはバクテリオファージT4 PNKであり、広範な基質特異性を有し、DNAまたはRNA基板の5末端に放射性同位体標識を組み込むための分子生物学研究室によって多く利用されている676、7、8、9、10、11、128,9,10,11,12である。,PNK酵素の別の例は、エウカヤ、ユースバクテリア、および古細菌に見られるCLP1であり、いくつかのRNA処理経路44、13、14、1513,14,15に関与している。
歴史的に、ポリヌクレオチドキナーゼ活性を測定するほとんどのアッセイは、放射性同位体標識とそれに続くオートラジオグラフィー55,1616に依存する。,近年では、単一分子アプローチ、マイクロチップ電気泳動、分子ビーコン、および,17、18、19、20、21、22の着色および発光ベースアッセイを含む、PNK活性を測定17,18,19するための追加アッセイが数多く開発されている。21,2220これらの新しいアプローチの多くは、検出限界を強化し、放射能の使用を回避しますが、コスト、固定樹脂への依存、および基板選択の制限などの欠点があります。
Grc3は、リボソーム前,RNA2,3,23,3の処理において極めて重要な役割を果たすポリヌクレオチドキナーゼである。23Grc3は、エンドリボヌクレアーゼLas1と共に、リボソームRNA3の内部転写スペーサー2(ITS2)を切断する義務複合体を形成する。Las1によるITS2の切断は、その後Grc3キナーゼ3によってリン酸化される5’ヒドロキシルを収容する製品を生成する。Grc3のヌクレオチドおよび基質特異性を調べるには、異なるオリゴヌクレオチド基質の検査を可能とする安価なアッセイが必要であった。そこで、蛍光標識基質を用いたPNKリン酸化アッセイが開発された。このアッセイは、Grc3がリン酸化伝達活動のために任意のNTPを利用できることを決定するためにうまく使用されたが、ATP24を支持する。このプロトコルは、元のアッセイを適応させ、その前リボソームRNA基質のRNA模倣物に対するGrc3のPNK活性を測定する(SC-ITS2、表1)。この蛍光ベースのアプローチの挑戦的な側面の1つは、リン酸化および非リン酸化基質を効果的に解決するための大きなポリアクリルアミドゲルへの依存である。プロトコルは、これらの大きなゲルを注ぐ方法についての具体的な詳細を提供し、そうするときに一般的な落とし穴を避ける。
RNAを使用する場合は、分解の影響を強く受けやすいため、特に注意が必要です。リボヌクレアーゼ汚染を制限するために取ることができる簡単な予防ステップがあります。RNase阻害剤含有洗浄剤で容易に処理できる別のRNAワークステーションは、しばしば有用である。試料の取り扱い時には常に手袋を着用し、RNaseフリーの認定消耗品を使用する必要があります。水は汚染の別の一般的な原因であるため、精製された水を使用し、0.22 μmのフィルターを使用してすべての溶液を殺菌するのが最善です。
Protocol
Representative Results
Discussion
説明は、蛍光標識ヌクレオチド基質に対するGrc3 PNKのキナーゼ活性を測定するアッセイである。このプロトコルは、反応バッファーとオリゴヌクレオチド基質を適応させることによって他の PNK 酵素を特徴付けるために適用できます。たとえば、プロトコルは EDTA のトレース量を必要とします。EDTAの添加は2つの理由で有益である:まず、このアプローチは、混合物中の微量の汚染金属に酵素が…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
アンドリュー・シッケマ博士とアンドレア・カミンスキー博士の批判的な原稿の読み方に感謝します。この研究は、米国国立衛生研究所の壁内研究プログラムによって支援されました。米国環境衛生研究所(NIEHS;ZIA ES103247からR.E.S)とカナダ保健研究所(CIHR;146626からM.C.P)へ。
Materials
| 0.4 mm 34-well comb | BioRad | 1653848 | |
| 0.4 mm spacer | BioRad | 1653812 | |
| 0.5 M EDTA ph 8.0 | KD Medical | RGF-3130 | |
| 1M Magnesium Chloride | KD Medical | CAC-5290 | |
| 1M Tris pH 8.0 | KD Medical | RGF-3360 | |
| 40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 | BioRad | 1610146 | |
| 5M Sodium Chloride | KD Medical | RGF-3720 | |
| ammonium persulfate (APS) | BioRad | 161-0700 | |
| ATP | Sigma | A2383-1G | |
| boric acid | Sigma | B0394 | |
| bromophenol blue sodium salt | Sigma | B5525-5G | |
| Glass Plates | Thomas Scientific | 1188K51 | |
| Hoefer SQ3 Sequencer | Hoefer | N/A | |
| Image J Software | N/A | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Labeled RNA oligonucleotides | IDT | Custom Order | |
| Pharmacia EPS 3500 Power Supply | Pharmacia | N/A | |
| Steriflip 0. 22 um Filter | Millipore | 5FCP00525 | |
| TEMED | BioRad | 161-0800 | |
| tris base | Sigma | TRIS-RO | |
| Typhoon FLA 9500 gel imager | GE Healthcare | N/A | |
| Ultra Pure DEPC Water | Invitrogen | 750023 | |
| Ultra Pure Glycerol | Invitrogen | 19E1056865 | |
| urea | Fisher Chemical | U15-500 |
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