Нерадиоактивный анализ для измерения полинуклеотида фосфорилирования малых нуклеотидных субстратов

Полинуклеотидные киназы (PNK) играют важную роль во многих путях обработки ДНК и РНК, таких как ремонт ДНК и рибосомная^{сборка 1,,2,,3,,4,,5.} Эти фундаментальные ферменты катализирует перенос терминального (гамма) монофосфата из нуклеозидного трифосфата (NTP, чаще всего АТФ) в 5′ гидроксиловый конец нуклеотидного субстрата. Один из наиболее хорошо характеризуется PNKs является бактериофаг T4 PNK, который имеет широкую специфику субстрата и в значительной степени используется молекулярной биологии лабораторий для включения радиоактивных изотопов этикетки на 5 конечной части ДНК или РНК^{субстрата 6,7,8,9,10,11,12}. Другим примером фермента PNK является CLP1, который находится в Eukarya, Eubacteria, и Archaea, и замешан в нескольких путей^{обработки РНК 4,13,14,15}.

Исторически сложилось так, что большинство анализов, которые измеряют активность полинуклеотида киназы зависят от радиоактивной маркировки изотопов и последующей^{ауторадиографии 5,16}. В последние годы был разработан ряд дополнительных анализов для измерения активности PNK, включая подходы к одной молекуле, электрофорез микрочипа, молекулярные маяки, а также колоритетрические и люминесцентные^{анализы 17,,18,,19,,20,,21,,22.} Хотя многие из этих новых подходов обеспечивают более расширенные пределы обнаружения и избегают использования радиоактивности, каждый из них имеет недостатки, такие, как стоимость, опора на иммобилизованную смолу и ограничения в выборе субстрата.

Grc3 является полинуклеотидной киназы, которая играет ключевую роль в обработке до рибосомной^{РНК 2,3,23}. Grc3 образует обязательный комплекс с эндорибонуклеазой Las1, которая расщепляет внутренний транскрибированный Spacer 2 (ITS2) до рибосомной^{РНК 3}. Расщепление ITS2 по Las1 генерирует продукт укрывательство 5′ гидроксил, который впоследствии фосфорилируется Grc3 киназы³. Для исследования нуклеотидной и субстратной специфичности Grc3 требовался недорогой анализ, который позволил провести тестирование различных олигонуклеотидных субстратов. Поэтому был разработан фосфорилирующий анализ PNK с использованием флуоресцентно помеченных субстратов. Этот анализ был успешно использован для определения того, что Grc3 может использовать любой NTP для передачи фосфорила деятельности, но выступает за^{АТФ 24}. Этот протокол адаптирует исходный анализ для измерения активности PNK Grc3 на РНК, имитируя его до рибосомный субстрат РНК (SC-ITS2, таблица 1). Одним из сложных аспектов этого подхода, основанного на флуоресценции, является использование крупных полиакриламидных гелей для эффективного решения фосфорилированных и нефосфорилированных субстратов. Протокол содержит конкретные сведения о том, как залить эти большие гели и избежать распространенных ловушек при этом.

Работа с РНК требует особого ухода, поскольку она сильно подвержена деградации. Есть простые профилактические шаги можно предпринять, чтобы ограничить загрязнение рибонуклеазы. Отдельная рабочая станция РНК, которую можно легко лечить с помощью ингибитора RNase, содержащего моющие средства часто полезно. Всегда носить перчатки при обработке образцов и использование RNase без сертифицированных расходных материалов необходимо. Поскольку вода является еще одним распространенным источником загрязнения, лучше всего использовать свежеочищенную воду и стерилизовать все растворы с помощью фильтра 0,22 мкм.