JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Niet-radioactieve test om polynucleotide fosforylatie van kleine nucleotide substraten te meten

Published: May 08, 2020
doi:
10.3791/61258
,
1Signal Transduction Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, Department of Health and Human Services,National Institutes of Health

Summary

Dit protocol beschrijft een niet-radioactieve test om kinase activiteit van polynucleotide kinases (PNKs) te meten op kleine DNA- en RNA-substraten.

Abstract

Polynucleotide kinases (PNKs) zijn enzymen die de fosforylatie van het 5’hydrcoxyleinde van DNA en RNA oligonunucleotiden katalyseren. De activiteit van PNKs kan worden gekwantificeerd met behulp van directe of indirecte benaderingen. Hier gepresenteerd is een directe, in vitro benadering om PNK activiteit die is gebaseerd op een fluorescerend gelabeld oligonucleotide substraat en polyacrylamide gel elektroforese te meten. Deze aanpak biedt een oplossing van de fosforgeyleerde producten en vermijdt het gebruik van radioactief gelabelde substraten. Het protocol beschrijft hoe de fosforylatiereactie in te stellen, grote polyacrylamidegels te bereiden en uit te voeren, en kwantificeren van de reactieproducten. Het meest technisch uitdagende deel van deze test is het gieten en uitvoeren van de grote polyacrylamide gels; Er worden dus belangrijke details verstrekt om gemeenschappelijke moeilijkheden te overwinnen. Dit protocol is geoptimaliseerd voor Grc3, een PNK die zich assembleert tot een verplicht pre-ribosomale RNA verwerkingscomplex met zijn bindingspartner, de Las1 nuclease. Dit protocol kan echter worden aangepast om de activiteit van andere PNK-enzymen te meten. Bovendien kan deze test ook worden gewijzigd om de effecten van verschillende componenten van de reactie te bepalen, zoals het nucleoside-sfosfaat, metaalionen en oligonucleotiden.

Introduction

Polynucleotide kinases (PNK) spelen een cruciale rol in veel DNA- en RNA-verwerkingstrajecten, zoals DNA-herstel en ribosoomassemblage1,2,,3,4,5. Deze fundamentele enzymen katalyseren de overdracht van het terminale (gamma) monofosfaat van een nucleoside triphosfaet (NTP, meestal ATP) naar het 5’hydroxyleinde van een nucleotideubstraat. Een van de meest goed gekarakteriseerde PNKs is bacteriofaag T4 PNK, die brede substraat specificiteit heeft en zwaar wordt gebruikt door moleculaire biologielaboratoria voor het opnemen van radioactieve isotopenlabels op het 5-eindpunt van een DNA- of RNA-substraat6,7,8,9,10,11,12. Een ander voorbeeld van een PNK-enzym is CLP1, dat wordt gevonden in Eukarya, Eubacteriën en Archaea, en is betrokken bij verschillende RNA-verwerkingstrajecten4,,13,,14,15.

Historisch gezien zijn de meeste tests die polynucleotide kinaseactiviteit meten afhankelijk van radioactieve isotopenetikettering endaaropvolgendeautoradiografie 5,16. In de afgelopen jaren zijn een aantal aanvullende tests ontwikkeld om de PNK-activiteit te meten, waaronder single molecule benaderingen, microchip elektroforese, moleculaire bakens, evenals colorimetrische en luminescentie-gebaseerde tests17,18,19,20,21,22. Hoewel veel van deze nieuwe benaderingen verbeterde detectielimieten bieden en het gebruik van radioactiviteit vermijden, heeft elk nadeel, zoals kosten, afhankelijkheid van geïmmobiliseerde hars en beperkingen in de keuze van het substraat.

Grc3 is een polynucleotide kinase die een centrale rol speelt bij de verwerking van preririmaal RNA2,3,23. Grc3 vormt een obligate complex met de endoribonuclease Las1, die de interne transcribed Spacer 2 (ITS2) van het pre-ribosomale RNA3splijt. Decolleté van de ITS2 door Las1 genereert een product met een 5′-hydroxyl dat vervolgens wordt gefossyleerd door de Grc3 kinase3. Om de nucleotide en substraatspecificiteit van Grc3 te onderzoeken, was een goedkope test nodig die het testen van verschillende oligonucleotide substraten mogelijk maakte. Daarom werd een PNK fosforylatietest ontwikkeld met fluorescerend gelabelde substraten. Deze test werd met succes gebruikt om te bepalen dat Grc3 elke NTP kan gebruiken voor fosforyloverdrachtactiviteit, maar bevoordeelt ATP24. Dit protocol past de oorspronkelijke test aan om de PNK-activiteit van Grc3 te meten op een RNA-nabootsing van het preririmaal RNA-substraat (SC-ITS2, tabel 1). Een uitdagend aspect van deze fluorescentie-gebaseerde aanpak is de afhankelijkheid van grote polyacrylamide gels om fosforyleerde en niet-phosphorylated substraten effectief op te lossen. Het protocol geeft specifieke details over hoe deze grote gels te gieten en te voorkomen dat gemeenschappelijke valkuilen wanneer dit te doen.

Werken met RNA vereist bijzondere zorg omdat het sterk gevoelig is voor afbraak. Er zijn eenvoudige preventieve stappen die men kan nemen om ribonuclease besmetting te beperken. Een apart RNA-werkstation dat gemakkelijk kan worden behandeld met een RNase-remmerhoudend reinigingsmiddel is vaak nuttig. Altijd handschoenen dragen bij het hanteren van monsters en het gebruik van RNase-vrije gecertificeerde verbruiksartikelen is noodzakelijk. Omdat water een andere veel voorkomende bron van verontreiniging is, is het het beste om vers gezuiverd water te gebruiken en alle oplossingen te steriliseren met behulp van een filter van 0,22 μm.

Protocol

1. Voorbereiding Buffer en reagentia voorbereiden. Maak 1x Reactiebuffer door 20 μL van 1 M Tris (pH = 8.0), 40 μL natriumchloride van 5 M, 2,5 μL van 2 M magnesiumchloride, 100 μL van 50% (v/v) glycerol en RNase-vrij water te combineren om een totaal volume van 1 mL te bereiken. Maak ureum ladingkleurstof door 4,8 g ureum te combineren, 200 μL van 1 M Tris (pH = 8.0), 20 μL van 0,5 M EDTA (pH = 8,0), 0,5 mL van 1% (w/v) bromofenolblauw en RNase-vrij water om een totaal volume van 10 mL…

Representative Results

Een succesvolle representatieve denaturerende gel van een titratie van ATP met een vaste hoeveelheid Las1-Grc3 complex wordt weergegeven in figuur 1. Toevoeging van enzym resulteerde in Las1-gemedieerd RNA decolleté van het SC-ITS2 RNA substraat, wat leidde tot een gedefinieerd RNA-fragment (5-OH C2 RNA). Na toevoeging van ATP werd het C2 RNA-fragment gefossyleerd door Grc3 PNK (5-P C2 RNA). Bij denatureringsgels migreert het fosforyleerde RNA sneller dan zi…

Discussion

Beschreven is een test om kinase activiteit van Grc3 PNK te meten op fluorescerend gelabelde nucleotide substraten. Dit protocol kan worden toegepast om andere PNK enzymen te karakteriseren door de Reaction Buffer en oligonucleotide substraat aan te passen. Het protocol vraagt bijvoorbeeld om een traceerbedrag van EDTA. De toevoeging van EDTA is gunstig om twee redenen: Ten eerste, deze aanpak bevordert magnesium-gebonden Grc3 door te voorkomen dat het enzym te binden om hoeveelheden vervuilende metalen in het mengsel te…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken Dr. Andrew Sikkema en Andrea Kaminski voor hun kritische lezing van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door het Us National Institute of Health Intramural Research Program; Us National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS; ZIA ES103247 aan R.E.S) en de Canadian Institutes of Health Research (CIHR; 146626 tot M.C.P).

Materials

0.4 mm 34-well comb BioRad 1653848
0.4 mm spacer BioRad 1653812
0.5 M EDTA ph 8.0 KD Medical RGF-3130
1M Magnesium Chloride KD Medical CAC-5290
1M Tris pH 8.0 KD Medical RGF-3360
40% Acrylamide/Bis Solution 29:1 BioRad 1610146
5M Sodium Chloride KD Medical RGF-3720
ammonium persulfate (APS) BioRad 161-0700
ATP Sigma A2383-1G
boric acid Sigma B0394
bromophenol blue sodium salt Sigma B5525-5G
Glass Plates Thomas Scientific 1188K51
Hoefer SQ3 Sequencer Hoefer N/A
Image J Software N/A N/A https://imagej.nih.gov/ij/
Labeled RNA oligonucleotides IDT Custom Order
Pharmacia EPS 3500 Power Supply Pharmacia N/A
Steriflip 0. 22 um Filter Millipore 5FCP00525
TEMED BioRad 161-0800
tris base Sigma TRIS-RO
Typhoon FLA 9500 gel imager GE Healthcare N/A
Ultra Pure DEPC Water Invitrogen 750023
Ultra Pure Glycerol Invitrogen 19E1056865
urea Fisher Chemical U15-500
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nuclease integrated kinase super assemblies (NiKs) and their role in RNA processing. Current Genetics. 64 (1), 183-190 (2018).
  2. Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 114 (28), E5530-E5538 (2017).
  3. Gasse, L., Flemming, D., Hurt, E. Coordinated Ribosomal ITS2 RNA Processing by the Las1 Complex Integrating Endonuclease, Polynucleotide Kinase, and Exonuclease Activities. Molecular Cell. 60 (5), 808-815 (2015).
  4. Dikfidan, A., et al. RNA specificity and regulation of catalysis in the eukaryotic polynucleotide kinase Clp1. Molecular Cell. 54 (6), 975-986 (2014).
  5. Bernstein, N. K., et al. The molecular architecture of the mammalian DNA repair enzyme, polynucleotide kinase. Molecular Cell. 17 (5), 657-670 (2005).
  6. Rio, D. C. 5′-end labeling of RNA with [gamma-32P]ATP and T4 polynucleotide kinase. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (4), 441-443 (2014).
  7. Paredes, E., Evans, M., Das, S. R. RNA labeling, conjugation and ligation. Methods. 54 (2), 251-259 (2011).
  8. Hilario, E. End labeling procedures: an overview. Molecular Biotechnology. 28 (1), 77-80 (2004).
  9. Eastberg, J. H., Pelletier, J., Stoddard, B. L. Recognition of DNA substrates by T4 bacteriophage polynucleotide kinase. Nucleic Acids Research. 32 (2), 653-660 (2004).
  10. Lillehaug, J. R., Kleppe, K. Kinetics and specificity of T4 polynucleotide kinase. Biochemistry. 14 (6), 1221-1225 (1975).
  11. Richardson, C. C. Phosphorylation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 54 (1), 158-165 (1965).
  12. Galburt, E. A., Pelletier, J., Wilson, G., Stoddard, B. L. Structure of a tRNA repair enzyme and molecular biology workhorse: T4 polynucleotide kinase. Structure. 10 (9), 1249-1260 (2002).
  13. Saito, M., et al. Large-Scale Molecular Evolutionary Analysis Uncovers a Variety of Polynucleotide Kinase Clp1 Family Proteins in the Three Domains of Life. Genome Biology Evolution. 11 (10), 2713-2726 (2019).
  14. Jain, R., Shuman, S. Characterization of a thermostable archaeal polynucleotide kinase homologous to human Clp1. RNA. 15 (5), 923-931 (2009).
  15. Weitzer, S., Hanada, T., Penninger, J. M., Martinez, J. CLP1 as a novel player in linking tRNA splicing to neurodegenerative disorders. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 6 (1), 47-63 (2015).
  16. Wang, L. K., Lima, C. D., Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO Journal. 21 (14), 3873-3880 (2002).
  17. Zhang, Y., Zhao, J., Chen, S., Li, S., Zhao, S. A novel microchip electrophoresis laser induced fluorescence detection method for the assay of T4 polynucleotide kinase activity and inhibitors. Talanta. 202, 317-322 (2019).
  18. Cui, L., Li, Y., Lu, M., Tang, B., Zhang, C. Y. An ultrasensitive electrochemical biosensor for polynucleotide kinase assay based on gold nanoparticle-mediated lambda exonuclease cleavage-induced signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 99, 1-7 (2018).
  19. Wang, L. J., Zhang, Q., Tang, B., Zhang, C. Y. Single-Molecule Detection of Polynucleotide Kinase Based on Phosphorylation-Directed Recovery of Fluorescence Quenched by Au Nanoparticles. Analytical Chemistry. 89 (13), 7255-7261 (2017).
  20. Liu, H., Ma, C., Wang, J., Chen, H., Wang, K. Label-free colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase/phosphatase activity and its inhibitors based on G-quadruplex/hemin DNAzyme. Analytical Biochemistry. 517, 18-21 (2017).
  21. Du, J., Xu, Q., Lu, X., Zhang, C. Y. A label-free bioluminescent sensor for real-time monitoring polynucleotide kinase activity. Analytical Chemistry. 86 (16), 8481-8488 (2014).
  22. Jiang, C., Yan, C., Jiang, J., Yu, R. Colorimetric assay for T4 polynucleotide kinase activity based on the horseradish peroxidase-mimicking DNAzyme combined with lambda exonuclease cleavage. Analytica Chimica Acta. 766, 88-93 (2013).
  23. Castle, C. D., et al. Las1 interacts with Grc3 polynucleotide kinase and is required for ribosome synthesis in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 41 (2), 1135-1150 (2013).
  24. Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex. RNA. 24 (5), 721-738 (2018).
  25. Geerlings, T. H., Vos, J. C., Raue, H. A. The final step in the formation of 25S rRNA in Saccharomyces cerevisiae is performed by 5′–>3′ exonucleases. RNA. 6 (12), 1698-1703 (2000).
  26. Pillon, M. C., et al. Cryo-EM reveals active site coordination within a multienzyme pre-rRNA processing complex. Nature Structural Molecular Biology. 26 (9), 830-839 (2019).
  27. Solomatin, S., Herschlag, D. Methods of site-specific labeling of RNA with fluorescent dyes. Methods in Enzymology. 469, 47-68 (2009).
  28. Giusti, W. G., Adriano, T. Synthesis and characterization of 5′-fluorescent-dye-labeled oligonucleotides. PCR Methods Application. 2 (3), 223-227 (1993).
  29. Petrov, A., Tsa, A., Puglisi, J. D. Analysis of RNA by analytical polyacrylamide gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 530, 301-313 (2013).

Tags

Polynucleotide KinasePhosphorylationDNARNASubstrateNonradioactive AssayAcrylamide GelDenaturing GelUreaTBE BufferRNA Enzyme Kinase ReactionsATP SubstrateQuenchingDownstream Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pillon, M. C., Stanley, R. E. Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates. J. Vis. Exp. (159), e61258, doi:10.3791/61258 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image