Ensaio nãoradioativo para medir a fosforilação de polinucleotídeos de substratos de pequenos nucleotídeos

As quinases de polinucleotídeos (PNK) desempenham papéis críticos em muitas vias de processamento de DNA e RNA, como reparação de DNA e conjunto ribossomo^{1,,2,,3,,4,,5}. Essas enzimas fundamentais catalisam a transferência do monofosfato terminal (gama) de um triptofato nucleosídeo (NTP, na maioria das vezes ATP) para a extremidade hidroxila de 5′ de um substrato nucleotídeo. Um dos PNKs mais bem caracterizados é o bacteriófago T4 PNK, que tem ampla especificidade de substrato e é fortemente utilizado por laboratórios de biologia molecular para incorporar rótulos de isótopos radioativos no 5 terminus de um substrato de DNA ou RNA^{6,7,,8,,9,10,,11,12}. Outro exemplo de enzima PNK é o CLP1, que é encontrado em Eukarya, Eubacteria e Archaea, e está implicado em várias vias de processamento de RNA^4,,13,,14,15.

Historicamente, a maioria dos ensaios que medem a atividade de quinase polinucleotídeo dependem da rotulagem de isótopos radioativos e da autoradiografia subsequente^5,16. Nos últimos anos, uma série de ensaios adicionais foram desenvolvidos para medir a atividade de PNK, incluindo abordagens de molécula única, eletroforese de microchip, balizas moleculares, bem como ensaios colorimétricos e baseados em luminescência^{17,,18,,19,,20,21,22}. Embora muitas dessas novas abordagens forneçam limites de detecção aprimorados e evitem o uso de radioatividade, cada uma tem desvantagens, como custo, dependência de resina imobilizada e limitações na escolha do substrato.

Grc3 é um polinucleotídeo quinase que desempenha um papel fundamental no processamento do RNA pré-ribossômico^2,3,23. Grc3 forma um complexo obrigatório com o endoribonuclease Las1, que corta o Spacer Transcrito Interno 2 (ITS2) do RNA pré-ribossômico³. O decote do ITS2 por Las1 gera um produto que abriga um hidroxil de 5′ que é posteriormente fosforilado pela quinase Grc3³. Para investigar a especificidade do nucleotídeo e substrato do Grc3, foi necessário um ensaio barato que permitia o teste de diferentes substratos oligonucleotídeos. Por isso, foi desenvolvido um ensaio de fosforilação PNK usando substratos fluorescentes rotulados. Este ensaio foi usado com sucesso para determinar que o Grc3 pode utilizar qualquer NTP para atividade de transferência de fosforila, mas favorece o ATP²⁴. Este protocolo adapta o ensaio original para medir a atividade PNK de Grc3 em uma mímica de RNA de seu substrato de RNA pré-ribossômico (SC-ITS2, Tabela 1). Um aspecto desafiador dessa abordagem baseada em fluorescência é a dependência de grandes géis de poliacrilamida para resolver efetivamente substratos fosforilados e não fosforilados. O protocolo fornece detalhes específicos sobre como derramar esses géis grandes e evitar armadilhas comuns ao fazê-lo.

Trabalhar com RNA requer cuidados particulares porque é fortemente suscetível à degradação. Existem medidas preventivas simples que se pode tomar para limitar a contaminação por ribonuclease. Uma estação de trabalho RNA separada que pode ser facilmente tratada com um agente de limpeza contendo inibidores de RNase é muitas vezes útil. É sempre necessário usar luvas ao manusear amostras e usar materiais de consumo certificados sem RNase. Como a água é outra fonte comum de contaminação, é melhor usar água recém-purificada e esterilizar todas as soluções usando um filtro de 0,22 μm.