הערכה של אירועי תאי רוצח טבעי אנושי המונעים על ידי מעורבות FcγRIIIa בנוכחות נוגדנים טיפוליים

הפרוטוקול הבא הוא בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של המחקר האנושי של iQ Bioscience. 1. בידוד מחשבי PBMCs והעשרה/טיהור של תאי NK הערה: ניתן לבצע גם שיטות אחרות לבידוד של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) והעשרה/טיהור. לצייר 200 מ”ל של דם בתנאים מוסדרים לתוך צינור המכיל הפרין. הוסף 15 מ”ל של מדיום הדרגתי צפיפות לתוך צינור 50 מ”ל עם מחסום נקבובי משולב. סובב את הצינור ב 1000 x g עבור 30 s. הוסף 12.5 מ”ל של דם לתוך הצינור ואחריו עוד 12.5 מ”ל של PBS, בעדינות להפוך 3x. לסובב את הצינור ב 800 x g במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ללא הפסקות. הכן צינור חרוטי 50 מ”ל עם 40 מ”ל של PBS עבור כל צינור עם מחסום נקבובי בזמן התאים מסתובבים. בזהירות להסיר את הצינורות ולבדוק לאחר צנטריפוגה. בדוק שכבה לבנה דקה, גלויה להפליא של PBMCs מעל המחסום הנקבובי, בין תיחום 20 מ”ל ו 25 מ”ל על צינור 50 מ”ל. יש להסיר בזהירות נוזלים רבים ככל האפשר מלמעלה באמצעות פיפטה מבלי להפריע לשכבת PBMC הדקה והלבנה. עם פיפטה סרולוגית נקייה של 10 מ”ל, הסר בעדינות את שכבת ה- PBMC בנוסף לשכבת הנוזל הצלולה והצהבהבה עד המסנן של הצינור. לגרש את PBMCs ונוזל לתוך חרוט 50 מ”ל המכיל PBS מוכן בשלב 1.4. ספין צינורות ב RT ו 300 x g במשך 5 דקות. שאפו את שטיפת PBS והוסיפו 40 מ”ל נוספים של PBS. ספין צינורות ב RT ו 300 x g במשך 5 דקות. לאחר הכביסה, לספור את התאים resuspend אותם ב 40 μL של 2% BSA / PBS לכל 1 x 107 תאים. המשך לבידוד של תאי NK בשיטת הבחירה. האפשרויות כוללות מיון ידני או אוטומטי מבוסס חרוזים מגנטיים9,21. מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות יכול להתבצע גם22. הסר aliquot קטן של תאים כדי לקבוע את הטוהר של תאי NK על ידי ציטומטריית זרימה. אסטרטגיית Gating כוללת את הדברים הבאים: שער על תאים חיים המבוססים על פרופיל פיזור קדימה לעומת צד, ולאחר מכן להעריך את הטוהר בהתבסס על סמני NK (למשל, CD3, CD56) באוכלוסייה החיה הספציפית. טוהר טיפוסי הוא >95%. לאחר השלמת הבידוד, ספין תאים ב RT ו 300 x g במשך 5 דקות כדי גלולה ושאיפה. resuspend הכדור התא ל 1 x 107 תאים / מ”ל ב RPMI 1640 עם חומרים מזינים, 10% FBS מומת בחום, 1 mM נתרן פירובט, 55 mM 2-ME, ו 10 mM HEPES (pH = 7.2). 2. הפעלה בתיווך נוגדנים של תאי NK באמצעות FcγRIIIa הגדר microcentrifuge בקירור ל 4 °C (5 °F). יש לפזר 1 x 106 (100 μL) של תאי NK תלויים מחדש לתוך צינורות 1.5 מ”ל ומניחים על קרח.הערה: תאים ניתן לחלק לתוך צלחת U-תחתון 96 גם אם יש דגימות רבות. הכן 1 μL של 100 מיקרוגרם / מ”ל rituximab (או נוגדן של עניין) לכל מדגם ולהוסיף 1 μL לתאים לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / mL נוגדן.הערה: ניתן להוסיף מולקולות אחרות לתאים בשלב זה או מוקדם יותר להערכת אפקטים משולבים. כאן, ritixumab שימש לגירוי. במחקרים קודמים, מעכבי מולקולות קטנות נוספו לגירויים9. לדגור על הדגימה על קרח במשך 30 דקות. במהלך הדגירה, להכין 50 μL של 50 מיקרוגרם / mL נוגדן שרשרת אור לכל מדגם במדיה לחום עד 37 °C (50 °F) על בלוק חום או באמבט מים. לאחר דגירה של תאים על קרח, להוסיף 1 מ”ל של מדיה קרה כקרח ספין ב 135 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). לשטוף שוב עם 1 מ”ל של קר קר קרח מדיה. שאפו את supernatant לאחר הכביסה האחרונה ולהוסיף 50 μL של תערובת שרשרת אור אנטי אנושית מוכן בשלב 2.5. מיד לדגור דגימות עבור משתמש הקצה קבע נקודות זמן ב 37 °C (55 °F) על בלוק חום או באמבט מים. להפסיק גירוי על ידי הוספת 1 מ”ל של מדיה קרה כקרח ומיד לסובב דגימות בצנטריפוגה בקירור ב 135 x g במשך 5 דקות. לשטוף שוב עם 1 מ”ל של מדיה קרה כקרח. 3. יישומים וקריאה במורד הזרם חקירה של מולקולות איתות בתאי NK מגורה FcγRIIIa על ידי ניתוח כתם מערביהערה: ניתן להשתמש במנגנוני הפרדת חלבון שונים והעברת ממברנה. לאחר הכביסה האחרונה עם מדיה קרה כקרח (שלב 2.8), תאי ליזה עם 20 μL של מאגר RIPA המכיל פוספטאז ומעכבי פרוטאז לערבב במשך 30 דקות על קרח. ספין צינורות ב 2100 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F). מעבירים את הליזאט לצינור 1.5 מ”ל נקי ומוסיפים את ריאגנטים הנדרשים להפרדת חלבון. להפריד חלבונים על ג’ל SDS-PAGE ולהעביר על קרום ניטרוצלולוז או PVDF בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים. לחסום ולחקור את הממברנה על פי גליון הנתונים של היצרן עבור נוגדן הזיהוי העיקרי (כאן, pAKT, pPRAS 40, ו pERK1/2 שימשו). הוסף נוגדן משני מצומד HRP ומחדש כימותרפיה לפי המלצות היצרן על קרום PVDF. השתמש בסרט רנטגן או בכלי זיהוי כדי לדמיין (כאן, pAKT זוהה ב 60 kDa, pPRAS40 ב 40 kDa, ו pERK1/2 ב 42 kDa ו 44 kDa). בידוד של mRNA והכנה לניתוח ביטוי גנים של תאי NK מגורה FcγRIIIa (טבלת חומרים) לאחר נקודת הזמן לגירוי הוא הגיע (שלב 2.7), מניחים את הצינור על קרח מיד להסתובב בצנטריפוגה בקירור ב 135 x g במשך 5 דקות (בדומה לשלב 2.8). הסר את supernatant ולשטוף 2x עם 1 מ”ל של PBS קר כקרח. תאי ליזה באמצעות חילוץ RNA גואנידון איזוטיווציאנאט(טבלת חומרים). השתמש ב- 1 מיקרוגרם של mRNA כדי לבצע תמלול הפוך באמצעות משושים אקראיים עם ערכהמסחרית (טבלת חומרים).הערה: כל שיטה של מיצוי RNA או סינתזת cDNA ניתן להשתמש9,23,24. להקפיא cDNA ב -20 °C עד ניתוח ביטוי גנים. הערכת ארגון מחדש של שלד ציטוסיאלי בתאי NK מגורה FcγRIIIa לאחר הכביסה האחרונה עם מדיה קרה כקרח (שלב 2.8), resuspend גלולה התא עם 50 μL של 3.7% paraformaldehyde במשך 10 דקות ב RT. הוסף 1 מ”ל של PBS ולסובב ב 135 x g במשך 5 דקות ב RT. חזור על כביסה זו פעם נוספת. הוסף 100 μL של 0.1% טריטון X-100/PBS למשך 5 דקות כדי לחדיר תאים, ותסובב תאים ב- 135 x g למשך 5 דקות ב- RT לכדור. הוסף 100 μL של 5 יחידות / מ”ל AF488-תווית פאלואידין מדולל ב 1% BSA / PBS ודגרה במשך 20 דקות ב RT. הוסף 1 מ”ל של PBS ולסובב ב 135 x g במשך 5 דקות ב RT לשטוף. resuspend גלולה התא בנפח הרצוי לניתוח ציטומטרי זרימה. הערכת degranulation של תאי NK מגורה FcγRIIIa באמצעות מכתים משטח CD107a לדגור על התאים עם הנוגדן של עניין על קרח כמתואר בשלבים 2.1-2.4. במהלך הדגירה, להכין 50 μL של תערובת נוגדנים לכל מדגם. הכן את התערובת במדיה התא עם ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / mL נוגדן שרשרת אור κ ו 1 מיקרוגרם / mL פלואורוכרום שכותרתו CD107a. לאחר הדגירה של התאים על הקרח, להוסיף 1 מ”ל של מדיה קרה כקרח. ספין ב 135 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F), ולאחר מכן לשטוף שוב עם 1 מ”ל של קרח קר מדיה. שאפו את supernatant לאחר הכביסה האחרונה, ולאחר מכן להוסיף 50 μL של תערובת שרשרת אור אנטי אנושית ודגרה ב 37 °C (57 °F) עבור נקודות הזמן הרצויות. בנקודות הזמן הרצויות, להוסיף 1 מ”ל של PBS ולסובב ב 135 x g במשך 5 דקות ב RT. לשאוף supernatant ולהוסיף 100 μL של 4% paraformaldehyde. דגירה ב RT במשך 10 דקות. הוסף 1 מ”ל של PBS ולסובב ב 135 x g במשך 5 דקות ב RT לשטוף. resuspend גלולה התא בנפח הרצוי לניתוח ציטומטרי זרימה. הערכה של ייצור כימוקין/ציטוקינים מתאי NK מגורה FcγRIIIaהערה: שיטות ו/או ערכות שונות עשויות לשמש להערכת ייצור כימוקין וציטוקינים. לאחר נקודת הזמן לגירוי הוא הגיע (שלב 2.7), מיד למקם את הצינור על קרח להסתובב צנטריפוגה בקירור ב 135 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F). מעבירים את הסופר-נט לכלי נקי. להקפיא את supernatant עד הערכת chemokine או ציטוקינים באמצעות ההסתה הרצויה.הערה: כדורי תאים יכולים כעת להיות שטף עם PBS קר כקרח ומעובד עבור איתות, ביטוי גנים, ומחקרי ארגון מחדש של שלד.