تقييم أحداث الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية مدفوعة بمشاركة FcγRIIIa في وجود أجسام مضادة علاجية
Summary
ويرد هنا وصف بروتوكول لدراسة الأحداث التي تحركها FcγRIIIa من قبل الأجسام المضادة العلاجية في الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية. تسمح منصة التحفيز الاصطناعي هذه باستجواب وظائف التأثير المصبي مثل إزالة التجريح ، وإنتاج chemokine / cytokine ، ومسارات الإشارات بوساطة أجزاء FcγRIIIa و Fc من الأجسام المضادة المشاركة في الربط.
Abstract
آلية واحدة للعمل من أجل الفعالية السريرية من قبل الأجسام المضادة العلاجية هو تعزيز الوظائف ذات الصلة بالمناعة، مثل إفراز السيتوكين والسمية الخلوية، مدفوعة FcγRIIIa (CD16) أعرب عن الخلايا القاتلة الطبيعية (NK). وقد أدت هذه الملاحظات إلى البحوث التي تركز على أساليب لزيادة الأحداث التي تتوسط فيها مستقبلات Fc ، والتي تشمل إزالة moiety فوكوز وجدت على الجزء Fc من الأجسام المضادة. وقد أوضح مزيد من الدراسات التغيرات الميكانيكية في الإشارات والعمليات الخلوية والخصائص السامة للخلايا التي تزيد من نشاط ADCC مع الأجسام المضادة afucosylated. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت دراسات أخرى الفوائد المحتملة لهذه الأجسام المضادة في تركيبة مع مثبطات جزيء صغير. وأظهرت هذه التجارب الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء فوائد استخدام الأجسام المضادة afucosylated في إعدادات الجمع. واستند العديد من هذه الملاحظات على اختبار تنشيط الاصطناعية في المختبر الذي تم تنشيط FcγRIIIa على خلايا ناغورني كاراباخ البشرية عن طريق الأجسام المضادة العلاجية. وفر هذا المقايسة المرونة لدراسة وظائف خلايا NK المثرى في المصب، مثل إنتاج السيتوكين والإزالة. وبالإضافة إلى ذلك، استخدم هذا المقايسة لاستجواب مسارات الإشارات وتحديد الجزيئات التي يمكن تحويرها أو استخدامها كمؤشرات بيولوجية. وأخيرا، أضيفت جزيئات علاجية أخرى (أي مثبطات جزيء صغير) إلى النظام لتوفير رؤى حول الجمع بين هذه العلاجات والأجسام المضادة العلاجية، وهو أمر ضروري في الفضاء السريري الحالي. تهدف هذه المخطوطة إلى توفير أساس تقني لإجراء هذا الفحص الاصطناعي لتنشيط خلايا NK البشرية. يوضح البروتوكول الخطوات الرئيسية لتنشيط الخلية بالإضافة إلى التطبيقات المحتملة المتلقين للمعلومات التي تتراوح من قراءات وظيفية إلى ملاحظات ميكانيكية أكثر.
Introduction
على مدى العقود القليلة الماضية، كان هناك تركيز هائل على تطوير علاجات السرطان المستهدفة باستخدام الأجسام المضادة. تعمل الأجسام المضادة العلاجية، مثل تراستوزوماب وريتوكسيماب، من خلال آليات متعددة، بما في ذلك الوقاية من تضاؤل جزيئات الإشارات وتعبئة الجهاز المناعي1،2. ويتم إنجاز هذا الأخير من خلال السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCC) ، والتي يتم فيها جلب الخلايا الليمفاوية التي تسمى خلايا القاتل الطبيعي (NK) إلى الخلية المستهدفة من قبل الأجسام المضادة1،2. عن طريق وضع الخلايا على مقربة من بعضها البعض، يتم تنشيط الخلية NK ويمكن lyse ورم / الخلية المستهدفة من خلال إفراز جزيئات التأثير3.
على المستوى الجزيئي، الجزء فاب من الأجسام المضادة يربط مستضد cognate أعرب عن الخلايا السرطانية، في حين أن الجزء Fc يشارك FcаRIIIa أعرب على خلايا NK لجمع الخلايا معا1،2. بعد مشاركة FcγRIIIa، مسارات الإشارات (أي، مسارات MAPK وPI3K) محرك إعادة ترتيب الهيكل الخلوي، وإنتاج السيتوكين، والسمية الخلوية4،5،6،7،8،9. وهكذا، ADCC هو حدث FcγRIIIa يحركها بوساطة خلايا ناغورني كاراباخ والأجسام المضادة.
ونظرا لأنه كان يعتقد أن ADCC هي آلية عمل لهذه الأجسام المضادة العلاجية ، فقد بحث الباحثون عن طرق لزيادة ADCC عن طريق تعديل الجسم المضاد. وكان أحد التعديلات إزالة فوكوز على سلسلة oligosaccharide تعلق على asparagine 297، مما يزيد من تقارب ملزمة من الجزء Fc من الأجسام المضادة إلى FcγRIIIa10،11،12. في الدراسات الحيوانية، أظهرت الفئران التي تتلقى أجساما مضادة مفوكوسلات أبطأ نمو الورم مقارنة مع الفئران تعامل مع نظيره fucosylated13. والأهم من ذلك، أظهر أوبينوتوزوماب (على سبيل المثال، غازيفا، وهو جهاز مضاد معتمد من الأفوكوسيلات) فعالية أفضل بالنسبة إلى ريتوكسيماب (على سبيل المثال، ريتوكسان، نظيره الفوكوسيلات) في المرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بسرطان الدم الليمفاوي المزمن أو سرطان الغدد الليمفاوية الجريبي14،15.
وحتى وقت قريب، كانت الآليات الكامنة وراء زيادة ADCC عن طريق الأجسام المضادة afucosylated غير معروفة. جنبا إلى جنب مع حقيقة أن هناك العديد من البرامج البحثية تطوير الأجسام المضادة العلاجية للاستفادة من آليات FcγRIIIa يحركها لاستهداف الخلايا السرطانية، فمن الضروري لتطوير المقايسات في المختبر التي تدرس الجوانب الجزيئية والخلوية التي تروج لها هذه الأجسام المضادة. وهذا يوفر فهما أساسيا لآليات العمل وكذلك إمكانية اكتشاف المؤشرات الحيوية. على هذا النحو، تم تطوير اختبار التنشيط الاصطناعي لدراسة وظائف FcγRIIIa التي تعتمد على الأجسام المضادة بالإضافة إلى الإشارات والخصائص الخلوية8. من خلال هذه الدراسات، تم توضيح الآليات الكامنة وراء زيادة فعالية الأجسام المضادة afucosylated التي تعزيز تقارب ملزم يزيد الإشارات لتعزيز خصائص الخلوية والخصائص السامة للخلايا8.
الاتجاه الحالي في التجارب السريرية هو استخدام مزيج من الجزيئات العلاجية16. واحدة من المسارات الأكثر تحورا هو مسار PI3K ، مما دفع إلى جهد هائل في تطوير مثبطات جزيء صغير تستهدف مكونات هذا المسار17،18،19،20. ومع ذلك ، فإن كيفية تصرف هذه الجزيئات بالاشتراك مع الأجسام المضادة العلاجية غير معروفة نسبيا ، خاصة في التركيبات التي قد يؤثر فيها المثبط على الجزيئات التي تتطلب مسار PI3K من أجل العمل ، مثل تلك التي تحركها الأجسام المضادة العلاجية.
وتحقيقا لهذه الغاية، تم استخدام المقايسة في المختبر المستخدمة لدراسات الأجسام المضادة afucosylated أيضا لدراسة مزيج من مثبطات PI3K والأجسام المضادة العلاجية. حددت هذه الدراسات الخصائص الجزيئية لتثبيط PI3K على الأحداث العلاجية التي يحركها PI3K ووصف كيف يمكن للأجسام المضادة afucosylated تعويض هذا الفقدان للإشارة9. هذه النتائج ذات صلة لأنها تقدم إرشادات محتملة لتصميم التجارب السريرية. بالإضافة إلى ذلك ، أدت هذه السلسلة من التجارب أيضا إلى الملاحظات الأولى الموصوفة للتنظيم الحركي لمسار إشارات PI3K لتعديل نسخ وإنتاج chemokine / cytokine ، والتي قد تكون بمثابة علامات بيولوجية محتملة9.
تم تصميم اختبار التنشيط الاصطناعي في المختبر المستخدم لتحديد الخصائص الإشارات والخلوية الموصوفة أعلاه لدراسة الأحداث التي تحركها FcγRIIIa في خلايا NK بوساطة الأجسام المضادة في غياب الخلايا المستهدفة. بدون خلايا مستهدفة في النظام، يمكن أن تعزى جميع أحداث الإشارات والوظائف التي تمت ملاحظتها مباشرة إلى خلايا NK. في المقايسة المقدمة، يتم إضافة الأجسام المضادة إلى خلايا NK المنقى، وعند هذه النقطة يربط الجزء Fc fcγRIIIa. ويتبع ذلك الربط المتبادل للأجسام المضادة باستخدام مضاد لسلسلة الضوء المضادة للإنسان لتحفيز الخلايا بشكل مصطنع. الربط المتبادل للأجسام المضادة يحاكي ربط مستضد الهدف لتوليد منصة الإشارات التي تثير أحداث المصب. اعتمادا على طول التحفيز، يمكن للباحثين تقييم الإشارات والعمليات الخلوية والخصائص السامة للخلايا، ووظائف التأثير8،9. وبالمثل، يوفر هذا المقايسة أيضا مرونة في دراسة هذه الأحداث عندما يتم الجمع بين الأجسام المضادة مع جزيئات أخرى9.
معا، وهذا هو المثل الأعلى في المختبر المقايسة لدراسة الأجسام المضادة العلاجية التي تثير استجابات خلايا NK من خلال FcγRIIIa بهم كجزء من آلية العمل. يصف هذا البروتوكول أداء هذا الفحص التنشيط في المختبر ويوفر نظرة ثاقبة قراءات المختلفة التي يمكن تنفيذها.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول أساليب لدراسة الأحداث التي تحركها FcγRIIIa في خلايا NK بوساطة الأجسام المضادة. هذه التقنيات تسمح بتقييم الآليات المحتملة للعمل من الأجسام المضادة العلاجية، والتي يقترح أن تكون ADCC1،2. على وجه التحديد، توفر هذه الطرق المرونة في دراسة مسارات الإشارات الجزيئية الأساسية والعمليات الخلوية المسؤولة عن ADCC. كما أنها تسمح بمراقبة وظائف التأثير الأخرى، مثل كيموكين وإنتاج السيتوكين. وبالإضافة إلى ذلك، تسمح هذه الأساليب بتحديد المؤشرات الحيوية والجزيئات المحتملة التي قد تستهدف تعديل مركز مكافحة التصحر.
أساس هذا البروتوكول هو التحفيز الاصطناعي لخلايا NK من خلال FcγRIIIa مع الأجسام المضادة في غياب الخلايا المستهدفة. الخلايا المستهدفة المرتبطة بالأجسام المضادة تعمل عادة على تعزيز الربط المتبادل لمستقبلات Fc لتشكيل منصة تدفع الإشارات وآثار المصب. بدلا من ذلك، يتم إنجاز الربط المتبادل باستخدام مضاد لسلسلة الضوء المضادة للإنسان κ في هذا المقايسة، متجاوزا الحاجة إلى الخلايا المستهدفة لتحفيز خلايا NK. بدون خلايا الهدف، يمكن أن تعزى النتائج والملاحظات مباشرة إلى خلايا NK، على افتراض أن عملية تنقية ناجحة.
الأهم من ذلك، وذلك باستخدام المضادة للإنسان κ الأجسام المضادة سلسلة ضوء لربط الأجسام المضادة لا تتداخل مع تقارب ملزمة من الجزء Fc لFcаRIIIa، وهو التفاعل الذي يملي قوة الاستجابة10،11،12،13. في الواقع، أظهرت الدراسات أن الأجسام المضادة afucosylated زيادة ADCC بسبب تقاربها المتزايد لFcаRIIIa10،11،12،13. وأظهرت الدراسات اللاحقة أن هذا التقارب المتزايد لا يتأثر ببديل الأجسام المضادة للإنسان المتسلسل الثانوي ويمكن استخدامه لدراسة أساس زيادة ADCC8. لضمان تحفيز الخلية NK من خلال الربط المتبادل للأجسام المضادة، ينبغي تضمين اثنين من الضوابط السلبية: 1) الأجسام المضادة العلاجية فقط دون المضادة للإنسانية الثانوية κ سلسلة ضوء الأجسام المضادة، و 2) الثانوية المضادة للإنسان κ سلسلة ضوء الأجسام المضادة فقط. وفي كلتا الحالتين، لا ينبغي توليد أي وظيفة للإشارة أو التأثير.
توفر هذه الطريقة أيضا مرونة لدراسة آثار الأجسام المضادة العلاجية على مثبطات الجزيئات الصغيرة. يمكن إضافة المثبط قبل الارتباط المتقاطع مع الجسم المضاد الثانوي بحيث يكون لدى المثبط الوقت لإشراك هدفه. ومع ذلك، ينبغي إجراء دراسات لتحديد الوقت الأمثل للمانع المعالجة المسبقة. وبالتالي ، فإن المثبط له تأثير أقصى على التحفيز. مع ذلك ، قد يختار الباحثون أيضا دراسة آثار المثبط بعد التحفيز. في هذه الحالة، يمكن إضافة المثبط بعد الربط المتبادل لدراسة كيفية تأثيره على الإشارات والعمليات التي يتم إنشاؤها بالفعل. معا، الطريقة الموصوفة هنا يوفر أقصى قدر من المرونة في دراسة الآثار combinatorial من مثبطات جزيء صغير مختلف مع الأجسام المضادة العلاجية.
كما ذكر أعلاه، يمكن إجراء مجموعة متنوعة من قراءات بعد التحفيز. يمكن إجراء النشاف الغربي لدراسة الإشارات باستخدام SDS-PAGE وأنظمة نقل الأغشية من مختلف البائعين. وبالمثل، يمكن أيضا تقييم التعبير الجيني باستخدام طرق استخراج الحمض النووي الريبي المختلفة، وأجهزة الكواشف النسخ العكسي، وأدوات التعبير الجيني. وأخيرا، يمكن أيضا تلطيخ البروتين داخل الخلايا أو خارج الخلية التي يمكن تحليل العينات باستخدام مقاييس تدفق مختلفة. للسيتوكين داخل الخلايا وCD107a تلطيخ (الخطوة 3.4, التي يمكن تقييمها في وقت واحد), وينبغي إضافة monensin و / أو brefeldin A لتحقيق أقصى قدر من الإشارات. لقد استخدمنا منصات مختلفة لكل هدف تجريبي وما زلنا نلاحظ نتائج مماثلة. لذلك ، يمكن استكمال الطريقة بأجهزة كاشفة ومنصات وأدوات مختلفة ، اعتمادا على الدراسة.
سيعتمد وقت الربط المتقاطع للتحفيز على هدف الدراسة. إذا رغبت في دراسات الإشارات، نموذجي وقت التحفيز عبر الوصلات بين 2 دقيقة و 10 دقيقة. pAKT، pPRAS40، وpERK1/2 تراكم قمم في 2 دقيقة ويختفي بعد 10 دقيقة8،9. للدراسات الوظيفية (أي تلك التي تنطوي على إنتاج chemokine / السيتوكين) ، يجب تحفيز الخلايا لمدة 30 دقيقة على الأقل ، اعتمادا على التحليل9. تحليل التعبير الجيني يتطلب أيضا عادة 30 دقيقة من التحفيز9. وينبغي توخي الحذر عند استخدام التعبير الجيني RANTES كمقروءة، كما RANTES mRNA الإنتاج مستقل عن التنشيط النسخي لأنه يتم تخزينها بالفعل في الخلايا للترجمة الفورية والإفراج عن البروتين عند التحفيز25. degranulation، في المقابل، يتطلب ما لا يقل عن 3 ساعة من التحفيز. على الرغم من هذه الملاحظات العامة، يجب على الباحثين إجراء دراسات حركية لتحديد وقت التحفيز الأمثل للجزيئات المعينة ذات الأهمية.
وبالمثل، يجب على الباحثين إعادة ترطيب الجسم المضاد المثير للاهتمام لتحديد التركيز الأمثل لأن الأجسام المضادة ذات الخصائص المختلفة ترتبط ب FcγRIIIa مع تقاربات مختلفة، حتى لو كانت من نفس النمط المتساوي. على سبيل المثال، ريتوكسيماب وتراستوزوماب كلاهما ايزوتيبي IgG1 ولكن trastuzumab يربط بقوة أكبر إلى تعدد الأشكال المزلج من FcγRIIIa من ريتوكسيماب26،27. هذا الاختلاف في التقارب قد يؤدي إلى اختلافات وظيفية، مثل التموج، كما لوحظ في الدراسات المنشورة8.
تحديد التركيز الأمثل مهم أيضا بسبب تقارب منخفض الجزء Fc من الأجسام المضادة لديه لFcаRIIIa. قد يؤدي هذا إلى غسل الأجسام المضادة لأن البروتوكول يتضمن خطوات الغسيل بعد ربط الجسم المضاد بمستقبلات Fc. وهذا قد يؤدي بعد ذلك إلى عدم وجود حساسية في المقايسات كما اقترح من قبل نسبة منخفضة من الخلايا الإيجابية CD107a بعد التحفيز (الشكل 5). ومع ذلك، فإن تحديد التركيز الأمثل ينبغي أن يوفر الثقة بأن النتائج لا تعزى إلى عدم وجود حساسية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تنشيط الخلايا بوضوح في المقايسات الكيميائية الحيوية والوظيفية التي تستخدم الخلية السائبة بدلا من قراءات الخلية الواحدة (الشكل 2، الشكل 3، الشكل 6).
البروتوكول محدود أيضا لأنه لا يحاكي تماما ما يحدث من الناحية الفسيولوجية. الأجسام المضادة للإنسانية الثانوية K المستخدمة هو تقليد الربط المتبادل الناتج عن مستضد الهدف المعبر عنه على الخلايا. هنا، يتم إضافة كمية مشبعة من الأجسام المضادة الثانوية لتوليد أقصى قدر من الاستجابة. ومع ذلك، فإن الخلايا المستهدفة المتميزة تعبر عن مستويات مختلفة من المستضد، مما سيؤثر على الروابط المتقاطعة والاستجابة. حاليا، لم يتم تحسين هذه المنصة لمحاكاة تأثيرات مستويات التعبير المستضد المختلفة.
وثمة عامل آخر ينبغي مراعاتها عند إجراء هذه التجارب هو التباين بين المانحين بسبب الخلفيات الوراثية المختلفة والتاريخ المناعي بين الأفراد. لذلك، يجب توخي الحذر عند مقارنة استجابات خلايا NK من مختلف الجهات المانحة عبر نفس المقايسات. وبالمثل، ينبغي التوصل إلى استنتاجات عامة فقط عند استخدام مختلف المانحين.
بالإجمال، الطريقة الموصوفة هي منصة تحفيز بسيطة ومرنة لدراسة الأجسام المضادة مدفوعة FcγRIIIa بوساطة الأحداث في خلايا NK. وقد استخدم لفهم أفضل لأساس زيادة ADCC وفعالية لوحظ مع الأجسام المضادة afucosylated8. كما استخدمت هذه الطريقة في دراسة تجمع بين الأجسام المضادة العلاجية ومثبطات جزيء صغير PI3K9. بالإضافة إلى ذلك، تم تحديد آلية لم تكن معروفة من قبل لإنتاج الكيموكين والسيتوكين التي تنظمها pS69. لذلك ، يمكن للدراسات المستقبلية التي تستخدم منصة الإشارات الاصطناعية هذه أن توضح آليات التنظيم لوظائف التأثير التي تحركها FcγRIIIa. كما أنه قد يحدد جزيئات جديدة مهمة لهذه الآليات وكذلك أدوار جديدة للجزيئات المعروفة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفان جيمس لي وكريستوفر نغ على تعليقات وتحرير هذه المخطوطة.
Materials
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| anti-mouse HRP antibody | Cell Signaling Technologies | 7076 | |
| AutoMACS instrument | Miltenyi | NK cell isolation method; another isolation instrument may be used | |
| B-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Bovine Serum Albumin Fraction V, fatty acid free | Millipore Sigma | 10775835001 | |
| CD107a APC antibody | Biolegend | 328620 | |
| Cytokine 30-Plex Human Panel | Thermo Fisher Scientific | LHC6003M | chemokine/cytokine method; another chemokine/cytokine analysis method may be used |
| FBS | Hyclone | SH30071.01 | |
| Goat anti-human κ light chain antibody | Millipore Sigma | AP502 | |
| Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78440 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | cDNA transcription method; used according to manufacturer's protocol |
| IFN-ɣ primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00989291_m1 | |
| Leukosep tube (50 ml conical with porous barrier) | Greiner | 227290 | |
| Lymphoprep (density gradient medium) | Stemcell | 7851 | |
| MIP-1⍺ primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00234142_m1 | |
| MIP-1β primers | Thermo Fisher Scientific | Hs99999148_m1 | |
| NK cell isolation kit | Miltenyi | 130-092-657 | NK cell isolation kit; another isolation kit may be used |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
| pAKT (S473) antibody | Cell Signaling Technologies | 4060 | |
| pERK1/2 antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
| pPRAS40 antibody | Cell Signaling Technologies | 13175 | |
| PVDF membrane | Thermo Fisher Scientific | nitrocellulose may be used | |
| RANTES primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 | |
| RIPA buffer | Millipore Sigma | R0278 | |
| RPMI w/glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61870 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| TNF-⍺ primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00174128_m1 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | 85111 | |
| TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation method; used according to manufacturer's protocol |
| Xcell Blot II Transfer Module | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
| Xcell SureLock Protein Gel Electrophoresis Chamber System | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
| β-actin HRP antibody | Abcam | ab6721 | |
| β-actin primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 |
References
- Hudis, C. A. Trastuzumab – Mechanism of Action and Use in Clinical Practice. New England Journal of Medicine. 357 (1), 39-51 (2007).
- Weiner, G. J. Rituximab: mechanism of action. Seminars inHhematology. 47 (2), 115-123 (2010).
- Orange, J. S. Formation and function of the lytic NK-cell immunological synapse. Nature Reviews Immunology. 8 (9), 713-725 (2008).
- Bonnema, J. D., Karnitz, L. M., Schoon, R. A., Abraham, R. T., Leibson, P. J. Fc receptor stimulation of phosphatidylinositol 3-kinase in natural killer cells is associated with protein kinase C-independent granule release and cell-mediated cytotoxicity. The Journal of Experimental Medicine. 180 (4), 1427-1435 (1994).
- Jiang, K., et al. Pivotal role of phosphoinositide-3 kinase in regulation of cytotoxicity in natural killer cells. Nature Immunology. 1 (5), 419-425 (2000).
- Kanakaraj, P., et al. Phosphatidylinositol-3 kinase activation induced upon Fc gamma RIIIA-ligand interaction. The Journal of Experimental Medicine. 179 (2), 551-558 (1994).
- Orange, J. S., Harris, K. E., Andzelm, M. M., Valter, M. M., Geha, R. S., Strominger, J. L. The mature activating natural killer cell immunologic synapse is formed in distinct stages. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 14151-14156 (2003).
- Liu, S. D., et al. Afucosylated Antibodies Increase Activation of FcγRIIIa-Dependent Signaling Components to Intensify Processes Promoting ADCC. Cancer Immunology Research. 3 (2), 173-183 (2015).
- Romeo, V., Gierke, S., Edgar, K. A., Liu, S. D. Effects of PI3K Inhibition on Afucosylated Antibody-Driven FcγRIIIa Events and Phospho-S6 Activity in NK Cells. The Journal of Immunology. 203 (1), 137-147 (2019).
- Mössner, E., et al. Increasing the efficacy of CD20 antibody therapy through the engineering of a new type II anti-CD20 antibody with enhanced direct and immune effector cell-mediated B-cell cytotoxicity. Blood. 115 (22), 4393-4402 (2010).
- Shields, R. L., et al. Lack of fucose on human IgG1 N-linked oligosaccharide improves binding to human Fcgamma RIII and antibody-dependent cellular toxicity. The Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 26733-26740 (2002).
- Shinkawa, T., et al. The absence of fucose but not the presence of galactose or bisecting N-acetylglucosamine of human IgG1 complex-type oligosaccharides shows the critical role of enhancing antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Journal of Biological Chemistry. 278 (5), 3466-3473 (2003).
- Junttila, T. T., et al. Superior In vivo Efficacy of Afucosylated Trastuzumab in the Treatment of HER2-Amplified Breast Cancer. Cancer Research. 70 (11), 4481-4489 (2010).
- Goede, V., et al. Obinutuzumab (GA101) plus chlorambucil (Clb) or rituximab (R) plus Clb versus Clb alone in patients with chronic lymphocytic leukemia (CLL) and preexisting medical conditions (comorbidities): Final stage 1 results of the CLL11 (BO21004) phase III trial. Journal of Clinical Oncology. 31, 7004 (2013).
- Sehn, L. H., et al. Randomized Phase II Trial Comparing Obinutuzumab (GA101) With Rituximab in Patients with Relapsed CD20+ Indolent B-Cell Non-Hodgkin Lymphoma: Final Analysis of the GAUSS Study. Journal of Clinical Oncology. 33 (30), 3467-3474 (2015).
- Pons-Tostivint, E., Thibault, B., Guillermet-Guibert, J. Targeting PI3K Signaling in Combination Cancer Therapy. Trends in Cancer. 3 (6), 454-469 (2017).
- Engelman, J. A. Targeting PI3K signalling in cancer: opportunities, challenges and limitations. Nature Reviews. Cancer. 9 (8), 550-562 (2009).
- Fruman, D. A., Rommel, C. PI3K and cancer: lessons, challenges and opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (2), 140-156 (2014).
- Janku, F., Yap, T. A., Meric-Bernstam, F. Targeting the PI3K pathway in cancer: are we making headway. Nature Reviews. Clinical Oncology. 15 (5), 273-291 (2018).
- Samuels, Y., et al. High frequency of mutations of the PIK3CA gene in human cancers. Science. 304 (5670), 554 (2004).
- Kanevskiy, L. M., Telford, W. G., Sapozhnikov, A. M., Kovalenko, E. I. Lipopolysaccharide induces IFN-γ production in human NK cells. Frontiers in Immunology. 4, (2013).
- Romagnani, C., et al. Activation of human NK cells by plasmacytoid dendritic cells and its modulation by CD4+ T helper cells and CD4+ CD25hi T regulatory cells. European Journal of Immunology. 35 (8), 2452-2458 (2005).
- Sivori, S., et al. CpG and double-stranded RNA trigger human NK cells by Toll-like receptors: Induction of cytokine release and cytotoxicity against tumors and dendritic cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (27), 10116-10121 (2004).
- Hanna, J., et al. Novel Insights on Human NK Cells’ Immunological Modalities Revealed by Gene Expression Profiling. The Journal of Immunology. 173 (11), 6547-6563 (2004).
- Swanson, B. J., Murakami, M., Mitchell, T. C., Kappler, J., Marrack, P. RANTES production by memory phenotype T cells is controlled by a posttranscriptional, TCR-dependent process. Immunity. 17 (5), 605-615 (2002).
- Jo, M., Kwon, H. S., Lee, K. H., Lee, J. C., Jung, S. T. Engineered aglycosylated full-length IgG Fc variants exhibiting improved FcγRIIIa binding and tumor cell clearance. mAbs. 10 (2), 278-289 (2018).
- Isoda, Y., et al. Importance of the Side Chain at Position 296 of Antibody Fc in Interactions with FcγRIIIa and Other Fcγ Receptors. PLoS ONE. 10 (10), 0140120 (2015).
