Terapötik Antikorların Varlığında FcφRIIIa Katılımı tarafından Yönlendirilen İnsan Doğal Öldürücü Hücre Olaylarının Değerlendirilmesi

Aşağıdaki protokol, iQ Bioscience’ın insan araştırma etik komitesinin yönergelerine uygundur. 1. PBMC’lerin izolasyonu ve NK hücrelerinin zenginleştirilmesi/saflaştırılması NOT: Periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC’ ler) izolasyonu ve zenginleştirme/saflaştırma için diğer yöntemler de yapılabilir. Düzenlenmiş koşullar altında heparin içeren bir tüpe 200 mL kan çekin. Gözenekli bir bariyer içeren 50 mL’lik bir tüpe 15 mL yoğunluk gradyanı ortamı ekleyin. Tüpü 30 s için 1000 x g’da döndürün. Tüpe 12,5 mL kan ekleyin ve ardından 12,5 mL pbs ekleyin ve 3x’i hafifçe ters çevirin. Tüpü 800 x g’da oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca kırılmadan döndürün. Hücreler dönerken gözenekli bariyerli her tüp için 40 mL PBS’li 50 mL konik bir tüp hazırlayın. Tüpleri dikkatlice çıkarın ve santrifüjden sonra inceleyin. 50 mL’lik tüpteki 20 mL ve 25 mL sınırlayıcılar arasında gözenekli bariyerin üzerinde ince, gözle görülür beyaz bir PBMC katmanı olup olmadığını kontrol edin. İnce, beyaz PBMC tabakasını bozmadan pipet kullanarak üstten mümkün olduğunca fazla sıvıyı dikkatlice çıkarın. Temiz bir 10 mL serolojik pipetle, pbmc tabakasını, berrak, sarımsı sıvı tabakasına ek olarak tüpün filtresine kadar hafifçe çıkarın. PBMC’leri ve sıvıyı adım 1.4’te hazırlanan PBS içeren 50 mL konik içine atın. RT’de spin tüpleri ve 5 dakika boyunca 300 x g. PBS yıkamayı aspire edin ve ek bir 40 mL PBS ekleyin. RT’de spin tüpleri ve 5 dakika boyunca 300 x g. Yıkadıktan sonra, hücreleri sayın ve 1 x 107 hücre başına% 2 BSA / PBS’nin 40 μL’sinde yeniden biriktirin. Tercih edilen yöntemi kullanarak NK hücrelerinin yalıtımine geçin. Seçenekler arasında manuel veya otomatik manyetik boncuk tabanlı sıralama9,21 bulunur. Floresan ile aktive hücre sıralama da yapılabilir22. Akış sitometrisi ile NK hücrelerinin saflığını belirlemek için küçük bir hücre aliquot’u çıkarın. Gating stratejisi aşağıdakileri içerir: ileriye ve yan dağılım profiline dayalı canlı hücreler üzerindeki kapı, daha sonra belirli canlı popülasyondaki NK işaretleyicilerine (örneğin, CD3, CD56) göre saflığı değerlendirin. Tipik saflık %>95’tir. İzolasyon tamamlandıktan sonra, hücreleri RT’de döndürün ve pelet ve aspirasyon için 5 dakika boyunca 300 x g çevirin. Hücre peletini besinlerle RPMI 1640’ta 1 x10 7 hücre/mL’ye, ısı inaktive FBS’ye, 1 mM sodyum piruvata, 55 mM 2-ME’ye ve 10 mM HEPES’e (pH = 7.2) yeniden harcayın. 2. FcφRIIIa aracılığıyla NK hücrelerinin antikor aracılı aktivasyonu Soğutmalı bir mikrosantrifüjü 4 °C’ye ayarlayın. Yeniden biriktirilmiş 1 x 106 (100 μL) NK hücrelerini 1,5 mL’lik tüplere dağıtın ve buza yerleştirin.NOT: Çok sayıda numune varsa hücreler 96 kuyu U-alt plakaya dağıtılabilir. Numune başına 1 μL 100 μg/mL rituksimab (veya ilgi antikoru) hazırlayın ve 1 μg/mL antikorun son konsantrasyonu için hücrelere 1 μL ekleyin.NOT: Kombinasyon etkilerinin değerlendirilmesi için bu noktada veya daha erken zamanda hücrelere başka moleküller eklenebilir. Burada ritixumab stimülasyon için kullanıldı. Daha önceki çalışmalarda, stimülasyonlara küçük molekül inhibitörleri eklenmiştir9. Numuneyi 30 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında, ortamda örnek başına 50 μg/mL anti-insan φ ışık zinciri antikorunu hazırlayın ve bir ısı bloğunda veya su banyosunda 37 °C’ye kadar ısıtın. Buzdaki hücrelerin inkübasyonundan sonra, 1 mL buz gibi ortam ekleyin ve 4 °C’de 5 dakika boyunca 135 x g’da döndürün. 1 mL buz soğuk medya ile tekrar yıkayın. Son yıkamadan sonra süpernatantı aspire edin ve adım 2.5’te hazırlanan anti-insan φ hafif zincir karışımının 50 μL’lik kısmını ekleyin. Son kullanıcı için numuneleri hemen bir ısı bloğunda veya bir su banyosunda 37 °C’de belirlenen zaman noktalarında kuluçkaya yatırın. 1 mL buz gibi ortam ekleyerek uyarımı durdurun ve numuneleri 5 dakika boyunca 135 x g’da soğutulmuş bir santrifüjde hemen döndürün. 1 mL buz gibi ortamla bir kez daha yıkayın. 3. Aşağı akış uygulamaları ve okumaları FcφRIIIa uyarılmış NK hücrelerindeki sinyal moleküllerinin batı blot analizi ile sorgulanarak sorgulandırılmasıNOT: Farklı protein ayırma ve membran transfer aparatları kullanılabilir. Buz gibi ortamla son yıkamadan sonra (adım 2.8), fosfataz ve proteaz inhibitörleri içeren 20 μL RIPA tamponlu lyse hücreleri buz üzerinde 30 dakika boyunca karışır. 2100 x g’da 4 °C’de 15 dakika boyunca döndürme tüpleri. Lisat temiz bir 1,5 mL tüpe aktarın ve protein ayırma için gerekli reaktifleri ekleyin. SDS-PAGE jel üzerindeki proteinleri ayırın ve standart protokolleri izleyerek bir nitroselüloz veya PVDF membranına aktarın. Birincil algılama antikoru için üreticinin veri sayfasına göre membranı bloke edin ve araştırın (burada pAKT, pPRAS 40 ve pERK1/2 kullanılmıştır). PVDF membranında üreticinin önerilerine göre HRP konjuge ikincil antikor ve chemiluminescence reaktif ekleyin. Görselleştirmek için X-ray film veya algılama cihazı kullanın (burada, pAKT 60 kDa’da, pPRAS40 40 kDa’da ve pERK1/2 42 kDa ve 44 kDa’da tespit edildi). mRNA’nın izolasyonu ve FcφRIIIa uyarılmış NK hücrelerinin gen ekspresyonanalizinehazırlık ( Malzeme Tablosu ) Stimülasyon için zaman noktasına ulaşıldıktan sonra (adım 2.7), tüpü buza yerleştirin ve hemen 5 dakika boyunca 135 x g’da (adım 2.8’e benzer) soğutmalı bir santrifüjde döndürün. Üst kısmı çıkarın ve 1 mL buz gibi PBS ile 2x yıkayın. Guanidium izotiyosiyanat RNA ekstraksiyonu kullanan Lyse hücreleri (Malzeme Tablosu). Ticari bir kit(Malzeme Masası)ile rastgele altıgenler kullanarak ters transkripsiyon gerçekleştirmek için 1 μg mRNA kullanın.NOT: RNA ekstraksiyonu veya cDNA sentezinin herhangi bir yöntemi9, 23,24kullanılabilir. Gen ekspresyon analizine kadar cDNA’yı -20 °C’de dondurun. FcφRIIIa uyarılmış NK hücrelerinde sitoskeletal yeniden düzenleme değerlendirmesi Buz gibi ortamla son yıkamadan sonra (adım 2.8), hücre peletini RT’de 10 dakika boyunca 50 μL% 3.7 paraformaldehit ile yeniden depola. 1 mL PBS ekleyin ve RT’de 5 dakika boyunca 135 x g’da döndürün. Hücrelerin dengesini sağlamak için 5 dakika boyunca %0,1 Triton X-100/PBS’nin 100 μL’sini ekleyin ve 135 x g’daki hücreleri 5 dakika boyunca RT’de peletleyin. %1 BSA/PBS’de seyreltilmiş 100 μL 5 birim/mL AF488 etiketli phalloidin ekleyin ve RT’de 20 dakika kuluçkaya yatırın. 1 mL PBS ekleyin ve yıkamak için RT’de 5 dakika boyunca 135 x g’da döndürün. Akış sitometrik analizi için hücre peletini istenen hacimde yeniden diriltin. CD107a yüzey boyama kullanılarak FcφRIIIa uyarılmış NK hücrelerinin degranülasyonunun değerlendirilmesi 2.1–2.4 adımlarında açıklandığı gibi hücreleri buz üzerindeki ilgi antikor ile kuluçkaya yatırın. Kuluçka sırasında, numune başına 50 μL antikor karışımı hazırlayın. Karışımı hücre ortamlarında 50 μg/mL anti-insan φ hafif zincir antikoru ve 1 μg/mL florokrom etiketli CD107a ile hazırlayın. Hücrelerin buz üzerinde inkübasyonundan sonra, 1 mL buz gibi ortam ekleyin. 4 °C’de 5 dakika boyunca 135 x g’da döndürün, ardından 1 mL buz soğuk ortamı ile tekrar yıkayın. Son yıkamadan sonra süpernatantı aspire edin, ardından anti-insan φ hafif zincir karışımından 50 μL ekleyin ve istenen zaman noktaları için 37 °C’de kuluçkaya yatın. İstediğiniz zaman noktalarında, 1 mL PBS ekleyin ve RT’de 5 dakika boyunca 135 x g’da döndürün. RT’de 10 dakika kuluçkaya yaslanın. 1 mL PBS ekleyin ve yıkamak için RT’de 5 dakika boyunca 135 x g’da döndürün. Akış sitometrik analizi için hücre peletini istenen hacimde yeniden diriltin. FcφRIIIa uyarılmış NK hücrelerinden kemokin/sitokin üretiminin değerlendirilmesiNOT: Kemokin ve sitokin üretiminin değerlendirilmesi için farklı yöntemler ve/veya kitler kullanılabilir. Stimülasyon için zaman noktasına ulaşıldıktan sonra (adım 2.7), tüpü hemen buza yerleştirin ve 4 °C’de 5 dakika boyunca 135 x g’da soğutmalı bir santrifüjde döndürün. Süpernatant temiz bir gemiye aktarın. İstenilen tahlil kullanarak kemokin veya sitokin değerlendirmesine kadar süpernatant dondurun.NOT: Hücre peletleri artık buz gibi PBS ile yıkanabilir ve sinyalizasyon, gen ekspresyolojisi ve sitoskeletal yeniden düzenleme çalışmaları için işlenebilir.