Een protocol voor het bestuderen van FcγRIIIa-gedreven gebeurtenissen door therapeutische antilichamen in menselijke natural killer cellen wordt hier beschreven. Dit kunstmatige stimulatieplatform maakt het mogelijk om stroomafwaartse effectorfuncties te onderzoeken, zoals degranulatie, chemokine / cytokineproductie en signaalroutes gemedieerd door de FcγRIIIa- en Fc-delen van antilichamen die betrokken zijn bij binding.
Een werkingsmechanisme voor klinische werkzaamheid door therapeutische antilichamen is de bevordering van immuungerelateerde functies, zoals cytokinesecretie en cytotoxiciteit, aangedreven door FcγRIIIa (CD16) uitgedrukt op natural killer (NK) cellen. Deze observaties hebben geleid tot onderzoek gericht op methoden om Fc-receptor-gemedieerde gebeurtenissen te verhogen, waaronder verwijdering van een fucose-deel dat wordt aangetroffen op het Fc-gedeelte van het antilichaam. Verdere studies hebben de mechanistische veranderingen in signalering, cellulaire processen en cytotoxische kenmerken opgehelderd die de ADCC-activiteit verhogen met afucosylated antilichamen. Bovendien hebben andere studies de potentiële voordelen van deze antilichamen in combinatie met kleine molecuulremmers aangetoond. Deze experimenten toonden de moleculaire en cellulaire mechanismen aan die ten grondslag liggen aan de voordelen van het gebruik van afucosylated antilichamen in combinatie-instellingen. Veel van deze waarnemingen waren gebaseerd op een kunstmatige in vitro activatie assay waarbij de FcγRIIIa op menselijke NK cellen werd geactiveerd door therapeutische antilichamen. Deze test bood de flexibiliteit om downstream effector NK-celfuncties te bestuderen, zoals cytokineproductie en degranulatie. Bovendien is deze test gebruikt om signaalroutes te ondervragen en moleculen te identificeren die kunnen worden gemoduleerd of gebruikt als biomarkers. Ten slotte zijn andere therapeutische moleculen (d.w.z. kleine molecuulremmers) aan het systeem toegevoegd om inzicht te geven in de combinatie van deze therapeutica met therapeutische antilichamen, wat essentieel is in de huidige klinische ruimte. Dit manuscript heeft tot doel een technische basis te bieden voor het uitvoeren van deze kunstmatige menselijke NK-celactiveringstest. Het protocol demonstreert belangrijke stappen voor celactivering en potentiële downstream-toepassingen die variëren van functionele uitlezingen tot meer mechanistische waarnemingen.
In de afgelopen decennia is er een enorme focus geweest op het ontwikkelen van gerichte kankertherapieën met behulp van antilichamen. Therapeutische antilichamen, zoals trastuzumab en rituximab, werken via meerdere mechanismen, waaronder de preventie van dimerisatie van signaalmoleculen en mobilisatie van het immuunsysteem1,2. Dit laatste wordt bereikt door antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC), waarbij lymfocyten die natural killer (NK) -cellen worden genoemd, door het antilichaam1,2naar een doelcel worden gebracht. Door de cellen in de nabijheid van elkaar te plaatsen, wordt de NK-cel geactiveerd en kan een tumor/ doelcel lyseren door de afscheiding van effectormoleculen3.
Op moleculair niveau bindt het Fab-gedeelte van het antilichaam zijn verwante antigeen dat tot expressie komt op de tumorcellen, terwijl het Fc-gedeelte de FcγRIIIa tot expressie brengt op NK-cellen om de twee cellen samen te brengen1,2. Na betrokkenheid van de FcγRIIIa stimuleren signaleringsroutes (d.w.z. MAPK- en PI3K-routes) cytoskeletale herschikking, cytokineproductie en cytotoxiciteit4,5,6,7,8,9. ADCC is dus een FcγRIIIa-gedreven gebeurtenis gemedieerd door NK-cellen en antilichamen.
Omdat ADCC werd beschouwd als een werkingsmechanisme voor deze therapeutische antilichamen, zochten onderzoekers naar methoden om ADCC te verhogen door het antilichaam te wijzigen. Een wijziging was de verwijdering van fucose op de oligosaccharideketen bevestigd aan asparagine 297, die de bindingsaffiniteit van het Fc-gedeelte van het antilichaam tegen de FcγRIIIa10,11,12verhoogt. In dierstudies vertoonden muizen die afucosylated antilichamen kregen een langzamere tumorgroei in vergelijking met muizen die werden behandeld met zijn gefucosyleerde tegenhanger13. Wat nog belangrijker is, obinutuzumab (bijv. Gazyva, een goedgekeurd afucosylated antilichaam) vertoonde een betere werkzaamheid ten opzichte van rituximab (bijv. Rituxan, zijn gefucosyleerde tegenhanger) bij patiënten met de diagnose chronische lymfatische leukemie of folliculair lymfoom14,15.
Tot voor kort waren de mechanismen die ten grondslag liggen aan verhoogde ADCC via afucosylated antilichamen onbekend. Gecombineerd met het feit dat er tal van onderzoeksprogramma’s zijn die therapeutische antilichamen ontwikkelen om FcγRIIIa-gestuurde mechanismen te gebruiken om kankercellen te targeten, is het noodzakelijk om in vitro assays te ontwikkelen die de moleculaire en cellulaire aspecten onderzoeken die door deze antilichamen worden bevorderd. Dit biedt fundamenteel inzicht in de werkingsmechanismen en het potentieel om biomarkers te ontdekken. Als zodanig werd een kunstmatige activeringstest ontwikkeld om antilichaamafhankelijke FcγRIIIa-gemedieerde functies te bestuderen naast signalering en cellulaire kenmerken8. Door middel van deze studies zijn de mechanismen die ten grondslag liggen aan de verhoogde werkzaamheid van afucosylated antilichamen opgehelderd, waarbij verbeterde bindingsaffiniteit de signalering verhoogt om cellulaire eigenschappen en cytotoxische kenmerken te bevorderen8.
De huidige trend in klinische studies is het gebruik van een combinatie van therapeutischemoleculen 16. Een van de meest gemuteerde routes is de PI3K-route, die enorme inspanningen heeft geleverd bij het ontwikkelen van kleine molecuulremmers die zich richten op componenten van deze route17,18,19,20. Toch is het relatief onbekend hoe deze moleculen werken in combinatie met therapeutische antilichamen, vooral in combinaties waarbij de remmer moleculen kan beïnvloeden die de PI3K-route nodig hebben om te functioneren, zoals die aangedreven door therapeutische antilichamen.
Hiertoe is de in vitro assay die wordt gebruikt voor de afucosylated antilichaamstudies ook gebruikt om de combinatie van PI3K-remmers en therapeutische antilichamen te bestuderen. Deze studies definieerden de moleculaire kenmerken van PI3K-remming op therapeutische antilichaam PI3K-gedreven gebeurtenissen en beschreven hoe afucosylated antilichamen dit verlies van signalering kunnen compenseren9. Deze bevindingen zijn relevant omdat ze potentiële richtlijnen bieden voor het ontwerpen van klinische onderzoeken. Bovendien leidde deze reeks experimenten ook tot de eerste beschreven waarnemingen voor kinetische regulatie van de PI3K-signaleringsroute om chemokine / cytokine-transcriptie en -productie te moduleren, die kunnen dienen als potentiële biomarkers9.
De kunstmatige in vitro activeringstest die wordt gebruikt om de hierboven beschreven signalerings- en cellulaire kenmerken te definiëren, is ontworpen om FcγRIIIa-gedreven gebeurtenissen in NK-cellen gemedieerd door antilichamen in afwezigheid van doelcellen te bestuderen. Zonder doelcellen in het systeem kunnen alle waargenomen signaleringsgebeurtenissen en functies rechtstreeks aan de NK-cellen worden toegeschreven. In de gepresenteerde test wordt antilichaam toegevoegd aan gezuiverde NK-cellen, waarna het Fc-gedeelte de FcγRIIIa bindt. Dit wordt gevolgd door crosslinking van het antilichaam met behulp van een anti-humaan κ lichte keten antilichaam om de cellen kunstmatig te stimuleren. Crosslinking van het antilichaam bootst de binding van het doelantigeen na om een signaleringsplatform te genereren dat stroomafwaartse gebeurtenissen veroorzaakt. Afhankelijk van de duur van de stimulatie kunnen onderzoekers signalering, cellulaire processen, cytotoxische kenmerken en effectorfunctiesbeoordelen 8,9. Evenzo biedt deze test ook flexibiliteit bij het bestuderen van deze gebeurtenissen wanneer antilichamen worden gecombineerd met anderemoleculen 9.
Samen is dit een ideale in vitro test om therapeutische antilichamen te bestuderen die NK-celresponsen opwekken via hun FcγRIIIa als onderdeel van het werkingsmechanisme. Dit protocol beschrijft de prestaties van deze in vitro activatie assay en geeft inzicht in de verschillende uitleringen die uitgevoerd kunnen worden.
Dit protocol beschrijft methoden voor het bestuderen van FcγRIIIa-gedreven gebeurtenissen in NK-cellen gemedieerd door antilichamen. Deze technieken maken de evaluatie mogelijk van potentiële werkingsmechanismen van therapeutische antilichamen, waarvan wordt gesuggereerd dat het ADCC1,2is. In het bijzonder bieden deze methoden flexibiliteit bij het bestuderen van onderliggende moleculaire signaalroutes en cellulaire processen die verantwoordelijk zijn voor ADCC. Ze maken ook observatie van andere effectorfuncties mogelijk, zoals chemokine en cytokineproductie. Bovendien maken deze methoden het mogelijk om potentiële biomarkers en moleculen te identificeren die kunnen worden gericht op het moduleren van ADCC.
De basis voor dit protocol is de kunstmatige stimulatie van NK-cellen via de FcγRIIIa met antilichamen in afwezigheid van doelcellen. Antilichaamgebonden doelcellen dienen meestal om de crosslinking van Fc-receptoren te bevorderen om een platform te vormen dat signalerings- en downstream-effecten aandrijft. In plaats daarvan wordt crosslinking bereikt met behulp van een anti-humaan κ lichtketenantilichaam in deze test, waarbij de noodzaak van doelcellen om de NK-cellen te stimuleren wordt omzeild. Zonder doelcellen kunnen de resultaten en waarnemingen direct aan de NK-cellen worden toegeschreven, ervan uitgaande dat het zuiveringsproces succesvol is.
Belangrijk is dat het gebruik van anti-humaan κ lichte ketenantilichaam om het antilichaam te crosslinken niet interfereert met de bindingsaffiniteit van het Fc-gedeelte voor de FcγRIIIa, een interactie die de sterkte van responsdicteert 10,11,12,13. Studies hebben inderdaad aangetoond dat afucosylated antilichamen ADCC verhogen vanwege hun verhoogde affiniteit voor de FcγRIIIa10,11,12,13. Latere studies toonden aan dat deze verhoogde affiniteit niet wordt beïnvloed door de anti-menselijke κ lichte keten secundaire antilichaamvervanger en kan worden gebruikt om de basis voor verhoogde ADCC8te bestuderen. Om ervoor te zorgen dat de NK-cel wordt gestimuleerd door crosslinking van het antilichaam, moeten twee negatieve controles worden opgenomen: 1) alleen therapeutisch antilichaam zonder het secundaire anti-menselijke κ lichte ketenantilichaam, en 2) het secundaire anti-menselijke κ lichte keten antilichaam alleen. In beide gevallen mag geen signalerings- of effectorfunctie worden gegenereerd.
Deze methode biedt ook flexibiliteit voor het bestuderen van de effecten van therapeutische antilichamen op kleine molecuulremmers. De remmer kan worden toegevoegd voordat deze wordt gekoppeld aan het secundaire antilichaam, zodat de remmer de tijd heeft om zijn doelwit te betrekken. Er moeten echter studies worden uitgevoerd om de optimale tijd van voorbehandeling van remmers te bepalen; de remmer heeft dus een maximaal effect op de stimulatie. Dat gezegd hebbende, kunnen onderzoekers er ook voor kiezen om de effecten van een remmer na stimulatie te bestuderen. In dit geval kan de remmer na crosslinking worden toegevoegd om te bestuderen hoe het signalen en processen beïnvloedt die al zijn gegenereerd. Samen biedt de hier beschreven methode maximale flexibiliteit bij het bestuderen van combinatorische effecten van verschillende kleine molecuulremmers met therapeutische antilichamen.
Zoals hierboven vermeld, kunnen verschillende uitleingen worden uitgevoerd na stimulatie. Western blotting kan worden uitgevoerd om signalering te bestuderen met behulp van SDS-PAGE en membraanoverdrachtssystemen van verschillende leveranciers. Evenzo kan genexpressie ook worden beoordeeld met behulp van verschillende RNA-extractiemethoden, reverse transcriptiereagentia en genexpressie-instrumenten. Ten slotte kan ook kleuring voor intracellulair of extracellulair eiwit worden uitgevoerd, waarbij monsters kunnen worden geanalyseerd met behulp van verschillende flowcytometers. Voor intracellulaire cytokine- en CD107a-kleuring (stap 3.4, die gelijktijdig kan worden beoordeeld), moeten monensine en/of brefeldine A worden toegevoegd om de signalen te maximaliseren. We hebben verschillende platforms gebruikt voor elk experimenteel doel en hebben nog steeds vergelijkbare resultaten waargenomen. Daarom kan de methode worden aangevuld met verschillende reagentia, platforms en instrumenten, afhankelijk van de studie.
De crosslinking tijd voor stimulatie zal afhangen van het doel van het onderzoek. Als signaleringsstudies gewenst zijn, ligt de typische crosslinking-stimulatietijd tussen 2 min en 10 min. pAKT, pPRAS40 en pERK1/2 accumulatie pieken op 2 min en verdwijnen na 10 min8,9. Voor functionele studies (d.w.z. die met chemokine / cytokineproductie) moeten cellen gedurende ten minste 30 minuten worden gestimuleerd, afhankelijk van de analyt9. Genexpressieanalyse vereist meestal ook 30 minutenstimulatie 9. Voorzichtigheid is geboden bij het gebruik van RANTES-genexpressie als uitlezing, omdat rantes-mRNA-productie onafhankelijk is van transcriptionele activering, omdat het al in cellen is opgeslagen voor snelle translatie en afgifte van eiwit bijstimulatie 25. Degranulatie vereist daarentegen minstens 3 uur stimulatie. Ondanks deze algemene observaties moeten onderzoekers kinetische studies uitvoeren om de optimale stimulatietijd voor de specifieke moleculen van belang te bepalen.
Evenzo moeten onderzoekers het antilichaam van belang titreren om de optimale concentratie te bepalen, omdat antilichamen met verschillende specifieke kenmerken binden aan FcγRIIIa met verschillende affiniteiten, zelfs als ze van hetzelfde isotype zijn. Rituximab en trastuzumab zijn bijvoorbeeld beide een IgG1-isotype, maar trastuzumab bindt sterker aan het valinepolymorfisme van FcγRIIIa dan rituximab26,27. Dit verschil in affiniteit kan leiden tot functionele verschillen, zoals degranulatie, zoals waargenomen in gepubliceerde studies8.
Het bepalen van de optimale concentratie is ook belangrijk vanwege de lage affiniteit die het Fc-gedeelte van het antilichaam heeft voor de FcγRIIIa. Dit kan resulteren in het afwassen van het antilichaam, omdat het protocol wasstappen omvat na binding van het antilichaam aan de Fc-receptor. Dit kan dan leiden tot een gebrek aan gevoeligheid in de assays zoals gesuggereerd door het lage percentage CD107a-positieve cellen na stimulatie(figuur 5). Het bepalen van de optimale concentratie moet echter vertrouwen geven dat de resultaten niet te wijten zijn aan een gebrek aan gevoeligheid. Bovendien worden cellen duidelijk geactiveerd in de biochemische en functionele assays die bulkcellen gebruiken in tegenstelling tot uitleingen van één cel(figuur 2, figuur 3, figuur 6).
Het protocol is ook beperkt omdat het niet volledig nabootst wat er fysiologisch gebeurt. Het secundaire anti-humane K-antilichaam dat wordt gebruikt, is om de crosslinking te imiteren die wordt gegenereerd door doelantigeen dat op cellen tot expressie komt. Hier wordt een verzadigde hoeveelheid secundair antilichaam toegevoegd om de maximale respons te genereren. Verschillende doelcellen zullen echter verschillende niveaus van antigeen tot expressie brengen, wat van invloed is op crosslinking en respons. Momenteel is dit platform niet geoptimaliseerd om de effecten van verschillende antigeenexpressieniveaus na te bootsen.
Een andere factor om te overwegen bij het uitvoeren van deze experimenten is donor-tot-donor variabiliteit als gevolg van verschillende genetische achtergronden en immunologische geschiedenissen tussen individuen. Daarom moet voorzichtig worden omgegaan met het vergelijken van NK-celresponsen van verschillende donoren over dezelfde testen. Evenzo mogen alleen algemene conclusies worden getrokken wanneer verschillende donoren worden gebruikt.
Al met al is de beschreven methode een eenvoudig en flexibel stimulatieplatform om antilichaamgestuurde FcγRIIIa-gemedieerde gebeurtenissen in NK-cellen te bestuderen. Het is gebruikt om de basis voor de verhoogde ADCC en werkzaamheid waargenomen met afucosylated antilichamen beter te begrijpen8. Deze methode werd ook gebruikt in een studie die therapeutische antilichamen en PI3K-remmers met kleine moleculen combineerde9. Bovendien werd een voorheen onbekend mechanisme voor chemokine- en cytokineproductie gereguleerd door pS6 geïdentificeerd9. Daarom kunnen toekomstige studies met behulp van dit kunstmatige signaleringsplatform mechanismen van regulatie voor effectorfuncties die worden aangedreven door de FcγRIIIa verder ophelderen. Het kan ook mogelijk nieuwe moleculen identificeren die belangrijk zijn voor deze mechanismen, evenals nieuwe rollen voor bekende moleculen.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs bedanken James Lee en Christopher Ng voor het commentaar en de redactie van dit manuscript.
16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
Alexa Fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
anti-mouse HRP antibody | Cell Signaling Technologies | 7076 | |
AutoMACS instrument | Miltenyi | NK cell isolation method; another isolation instrument may be used | |
B-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V, fatty acid free | Millipore Sigma | 10775835001 | |
CD107a APC antibody | Biolegend | 328620 | |
Cytokine 30-Plex Human Panel | Thermo Fisher Scientific | LHC6003M | chemokine/cytokine method; another chemokine/cytokine analysis method may be used |
FBS | Hyclone | SH30071.01 | |
Goat anti-human κ light chain antibody | Millipore Sigma | AP502 | |
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific | 78440 | |
HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | cDNA transcription method; used according to manufacturer's protocol |
IFN-ɣ primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00989291_m1 | |
Leukosep tube (50 ml conical with porous barrier) | Greiner | 227290 | |
Lymphoprep (density gradient medium) | Stemcell | 7851 | |
MIP-1⍺ primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00234142_m1 | |
MIP-1β primers | Thermo Fisher Scientific | Hs99999148_m1 | |
NK cell isolation kit | Miltenyi | 130-092-657 | NK cell isolation kit; another isolation kit may be used |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
pAKT (S473) antibody | Cell Signaling Technologies | 4060 | |
pERK1/2 antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
pPRAS40 antibody | Cell Signaling Technologies | 13175 | |
PVDF membrane | Thermo Fisher Scientific | nitrocellulose may be used | |
RANTES primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 | |
RIPA buffer | Millipore Sigma | R0278 | |
RPMI w/glutamax | Thermo Fisher Scientific | 61870 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
TNF-⍺ primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00174128_m1 | |
Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | 85111 | |
TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA isolation method; used according to manufacturer's protocol |
Xcell Blot II Transfer Module | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
Xcell SureLock Protein Gel Electrophoresis Chamber System | Thermo Fisher Scientific | another protein separation system may be used | |
β-actin HRP antibody | Abcam | ab6721 | |
β-actin primers | Thermo Fisher Scientific | Hs00982282_m1 |