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Immunology and Infection

Evaluación de los eventos de células asesinas naturales humanas impulsados por la participación de FcγRIIIa en presencia de anticuerpos terapéuticos

Published: May 22, 2020
doi:
10.3791/61144
, , , , , ,
1Department of Research and Development,iQ Biosciences, 2Department of Cellular Products,iQ Biosciences

Summary

Aquí se describe un protocolo para estudiar los eventos impulsados por FcγRIIIa por anticuerpos terapéuticos en células asesinas naturales humanas. Esta plataforma de estimulación artificial permite el interrogatorio de funciones efectoras aguas abajo, como la degranulación, la producción de quimiocinas / citoquinas y las vías de señalización mediadas por las porciones FcγRIIIa y Fc de anticuerpos involucrados en la unión.

Abstract

Un mecanismo de acción para la eficacia clínica de los anticuerpos terapéuticos es la promoción de funciones relacionadas con el sistema inmunitario, como la secreción de citoquinas y la citotoxicidad, impulsada por FcγRIIIa (CD16) expresada en células asesinas naturales (NK). Estas observaciones han llevado a la investigación centrada en métodos para aumentar los eventos mediados por el receptor Fc, que incluyen la eliminación de una fracción de fucosa que se encuentra en la porción Fc del anticuerpo. Estudios posteriores han dilucidado los cambios mecanicistas en la señalización, los procesos celulares y las características citotóxicas que aumentan la actividad del ADCC con anticuerpos afucosilados. Además, otros estudios han demostrado los beneficios potenciales de estos anticuerpos en combinación con inhibidores de moléculas pequeñas. Estos experimentos demostraron los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a los beneficios del uso de anticuerpos afucosilados en entornos de combinación. Muchas de estas observaciones se basaron en un ensayo de activación artificial in vitro en el que el FcγRIIIa en células NK humanas fue activado por anticuerpos terapéuticos. Este ensayo proporcionó la flexibilidad para estudiar las funciones de las células NK efectoras aguas abajo, como la producción de citoquinas y la degranulación. Además, este ensayo se ha utilizado para interrogar las vías de señalización e identificar moléculas que pueden ser moduladas o utilizadas como biomarcadores. Finalmente, se han agregado otras moléculas terapéuticas (es decir, inhibidores de moléculas pequeñas) al sistema para proporcionar información sobre la combinación de estas terapias con anticuerpos terapéuticos, que es esencial en el espacio clínico actual. Este manuscrito tiene como objetivo proporcionar una base técnica para realizar este ensayo de activación de células NK humanas artificiales. El protocolo muestra pasos clave para la activación celular, así como posibles aplicaciones posteriores que van desde lecturas funcionales hasta observaciones más mecanicistas.

Introduction

En las últimas décadas, ha habido un gran enfoque en el desarrollo de terapias dirigidas contra el cáncer utilizando anticuerpos. Los anticuerpos terapéuticos, como trastuzumab y rituximab, operan a través de múltiples mecanismos, incluyendo la prevención de la dimerización de moléculas de señalización y la movilización del sistema inmune1,2. Esto último se logra a través de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), en la que los linfocitos llamados células asesinas naturales (NK) son llevados a una célula objetivo por el anticuerpo1,2. Al colocar las células en proximidad entre sí, la célula NK se activa y puede lisionarse un tumor / célula diana a través de la secreción de moléculas efectoras3.

A nivel molecular, la porción Fab del anticuerpo se une a su antígeno cognado expresado en las células tumorales, mientras que su porción FcγRIIIa expresada en células NK para unir las dos células1,2. Después de la participación de la FcγRIIIa, las vías de señalización (es decir, las vías MAPK y PI3K) impulsan el reordenamiento citoesquelético, la producción de citoquinas y la citotoxicidad4,5,6,7,8,9. Por lo tanto, ADCC es un evento impulsado por FcγRIIIa mediado por células NK y anticuerpos.

Debido a que se pensaba que ADCC era un mecanismo de acción para estos anticuerpos terapéuticos, los investigadores buscaron métodos para aumentar ADCC modificando el anticuerpo. Una modificación fue la eliminación de la fucosa en la cadena de oligosacáridos unida a la asparagina 297, lo que aumenta la afinidad de unión de la porción Fc del anticuerpo a la FcγRIIIa10,11,12. En estudios con animales, los ratones que recibieron anticuerpos aucosilados exhibieron un crecimiento tumoral más lento en comparación con los ratones tratados con su contraparte fucosilada13. Más importante aún, obinutuzumab (por ejemplo, Gazyva, un anticuerpo afucosilado aprobado) mostró una mejor eficacia en relación con rituximab (por ejemplo, Rituxan, su contraparte fucosilada) en pacientes diagnosticados con leucemia linfocítica crónica o linfoma folicular14,15.

Hasta hace poco, se desconocía el aumento de ADCC a través de anticuerpos afucosilados. Combinado con el hecho de que existen numerosos programas de investigación que desarrollan anticuerpos terapéuticos para utilizar mecanismos impulsados por FcγRIIIa para atacar las células cancerosas, es imperativo desarrollar ensayos in vitro que examinen los aspectos moleculares y celulares promovidos por estos anticuerpos. Esto proporciona una comprensión fundamental de los mecanismos de acción, así como el potencial para descubrir biomarcadores. Como tal, se desarrolló un ensayo de activación artificial para estudiar las funciones mediadas por FcγRIIIa dependientes de anticuerpos, además de la señalización y las características celulares8. A través de estos estudios, se han dilucidado los mecanismos que subyacen al aumento de la eficacia de los anticuerpos afinesilados en los que la afinidad de unión mejorada aumenta la señalización para promover las propiedades celulares y las características citotóxicas8.

La tendencia actual en los ensayos clínicos es el uso de una combinación de moléculas terapéuticas16. Una de las vías más comúnmente mutadas es la vía PI3K, que ha provocado un tremendo esfuerzo en el desarrollo de inhibidores de moléculas pequeñas que se dirigen a los componentes de esta vía17,18,19,20. Sin embargo, la forma en que estas moléculas actúan en combinación con anticuerpos terapéuticos es relativamente desconocida, especialmente en combinaciones donde el inhibidor puede afectar a moléculas que requieren la vía PI3K para funcionar, como las impulsadas por anticuerpos terapéuticos.

Con este fin, el ensayo in vitro empleado para los estudios de anticuerpos aucosilados también se ha utilizado para estudiar la combinación de inhibidores de PI3K y anticuerpos terapéuticos. Estos estudios definieron las características moleculares de la inhibición de PI3K en eventos terapéuticos impulsados por anticuerpos PI3K y describieron cómo los anticuerpos aucosilados pueden compensar esta pérdida de señalización9. Estos hallazgos son relevantes ya que brindan orientación potencial para diseñar ensayos clínicos. Además, esta serie de experimentos también condujo a las primeras observaciones descritas para la regulación cinética de la vía de señalización PI3K para modular la transcripción y producción de quimiocinas / citoquinas, que pueden servir como biomarcadores potenciales9.

El ensayo de activación artificial in vitro utilizado para definir la señalización y las características celulares descritas anteriormente ha sido diseñado para estudiar eventos impulsados por FcγRIIIa en células NK mediadas por anticuerpos en ausencia de células diana. Sin células objetivo en el sistema, todos los eventos y funciones de señalización observados se pueden atribuir directamente a las células NK. En el ensayo presentado, se agrega anticuerpo a las células NK purificadas, momento en el cual la porción Fc se une a la FcγRIIIa. Esto es seguido por la reticulación del anticuerpo utilizando un anticuerpo de cadena ligera κ anti-humano para estimular artificialmente las células. La reticulación del anticuerpo imita la unión del antígeno objetivo para generar una plataforma de señalización que provoca eventos posteriores. Dependiendo de la duración de la estimulación, los investigadores pueden evaluar la señalización, los procesos celulares, las características citotóxicas y las funciones efectoras8,9. Del mismo modo, este ensayo también proporciona flexibilidad en el estudio de estos eventos cuando los anticuerpos se combinan con otras moléculas9.

En conjunto, este es un ensayo in vitro ideal para estudiar anticuerpos terapéuticos que provocan respuestas de células NK a través de su FcγRIIIa como parte del mecanismo de acción. Este protocolo describe el rendimiento de este ensayo de activación in vitro y proporciona información sobre las diversas lecturas que se pueden realizar.

Protocol

El siguiente protocolo está de acuerdo con las directrices del comité de ética de investigación humana de iQ Bioscience. 1. Aislamiento de PBMC y enriquecimiento/purificación de células NK NOTA: También se pueden realizar otros métodos para el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y el enriquecimiento/purificación. Extraiga 200 ml de sangre en condiciones reguladas en un tubo que contenga heparina. Agregue 15 ml del medio de gradiente de densidad en un tubo de 50 ml con una barrera porosa incorporada. Girar el tubo a 1000 x g durante 30 s. Agregue 12.5 ml de sangre en el tubo seguido de otros 12.5 ml de PBS e invierta suavemente 3x. Gire el tubo a 800 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT) sin interrupciones. Prepare un tubo cónico de 50 ml con 40 ml de PBS para cada tubo con una barrera porosa mientras las células están girando. Retire cuidadosamente los tubos e inspeccione después de la centrifugación. Compruebe si hay una capa delgada y visiblemente blanca de PBMC por encima de la barrera porosa, entre las demarcaciones de 20 ml y 25 ml en el tubo de 50 ml. Retire con cuidado la mayor cantidad de líquido posible de la parte superior con una pipeta sin perturbar la capa delgada y blanca de PBMC. Con una pipeta serológica limpia de 10 ml, retire suavemente la capa de PBMC además de la capa líquida transparente y amarillenta hasta el filtro del tubo. Expulse los PBMC y el líquido en el PBS cónico de 50 ml que contiene preparado en la etapa 1.4. Tubos de centrifugado a RT y 300 x g durante 5 min. Aspire el lavado de PBS y agregue 40 ml adicionales de PBS. Tubos de centrifugado a RT y 300 x g durante 5 min. Después del lavado, cuente las células y vuelva a sususpendlas en 40 μL de BSA/PBS al 2% por 1 x 107 células. Proceda al aislamiento de las células NK utilizando el método de elección. Las opciones incluyen la clasificación manual o automatizada basada en cuentasmagnéticas 9,21. También se puede realizar la clasificación celular activada por fluorescencia22. Extraer una pequeña alícuota de células para determinar la pureza de las células NK mediante citometría de flujo. La estrategia de gating incluye lo siguiente: puerta en células vivas basada en el perfil de dispersión hacia adelante vs. lado, luego evaluar la pureza basada en marcadores NK (por ejemplo, CD3, CD56) en la población viva específica. La pureza típica es de >95%. Después de completar el aislamiento, gire las células a RT y 300 x g durante 5 min para gletizar y aspirar. Resuspend el pellet celular a 1 x 107 células/mL en RPMI 1640 con nutrientes, 10% FBS inactivado por calor, 1 mM piruvato de sodio, 55 mM 2-ME y 10 mM HEPES (pH = 7.2). 2. Activación mediada por anticuerpos de células NK a través de FcγRIIIa Fije una microcentrífuga refrigerada a 4 °C. Dispensar 1 x 106 (100 μL de) células NK resuspendidas en tubos de 1,5 ml y colocar sobre hielo.NOTA: Las células se pueden dispensar en una placa de fondo en U de 96 pozos si hay numerosas muestras. Preparar 1 μL de 100 μg/ml de rituximab (o anticuerpo de interés) por muestra y añadir 1 μL a las células para obtener una concentración final de 1 μg/ml de anticuerpos.NOTA: Se pueden agregar otras moléculas a las células en este punto o antes para la evaluación de los efectos de la combinación. Aquí, ritixumab se utilizó para la estimulación. En estudios previos, se han añadido inhibidores de moléculas pequeñas a las estimulaciones9. Incubar la muestra en hielo durante 30 min. Durante la incubación, preparar 50 μL de anticuerpos de cadena ligera antihumanos κ de 50 μg/mL por muestra en medios y calientes a 37 °C en un bloque de calor o en un baño de agua. Después de la incubación de las células en hielo, agregue 1 ml de medios helados y gire a 135 x g durante 5 min a 4 ° C. Lavar de nuevo con 1 ml de medio helado. Aspire el sobrenadante después del último lavado y agregue 50 μL de la mezcla de cadena ligera antihumana κ preparada en la etapa 2.5. Incubar inmediatamente muestras para los puntos de tiempo determinados por el usuario final a 37 °C en un bloque de calor o en un baño de agua. Detenga la estimulación agregando 1 ml de medios helados e inmediatamente gire las muestras en una centrífuga refrigerada a 135 x g durante 5 minutos. Lavar una vez más con 1 ml de medios helados. 3. Aplicaciones y lecturas posteriores Interrogatorio de moléculas de señalización en células NK estimuladas por FcγRIIIa mediante análisis de western blotNOTA: Se pueden utilizar diferentes aparatos de separación de proteínas y transferencia de membrana. Después del último lavado con medios helados (paso 2.8), las células de lisia con 20 μL de tampón RIPA que contienen fosfatasa e inhibidores de la proteasa se mezclan durante 30 min en hielo. Tubos de centrifugado a 2100 x g durante 15 min a 4 °C. Transfiera el lisato a un tubo limpio de 1,5 ml y agregue los reactivos necesarios para la separación de proteínas. Separe las proteínas en el gel SDS-PAGE y transfiéralas a una membrana de nitrocelulosa o PVDF siguiendo los protocolos estándar. Bloquee y sondee la membrana de acuerdo con la hoja de datos del fabricante para el anticuerpo de detección primaria (aquí, se utilizaron pAKT, pPRAS 40 y pERK1/2). Agregue anticuerpos secundarios conjugados HRP y reactivo de quimioluminescencia según las recomendaciones del fabricante en la membrana de PVDF. Utilice una película de rayos X o un instrumento de detección para visualizar (aquí, pAKT se detectó a 60 kDa, pPRAS40 a 40 kDa y pERK1/2 a 42 kDa y 44 kDa). Aislamiento de ARNm y preparación para el análisis de expresión génica de células NK estimuladas por FcγRIIIa (Tabla de Materiales) Después de alcanzar el punto de tiempo para la estimulación (paso 2.7), coloque el tubo sobre hielo e inmediatamente gire en una centrífuga refrigerada a 135 x g durante 5 minutos (similar al paso 2.8). Retire el sobrenadante y lave 2x con 1 ml de PBS helado. Células de Liso utilizando extracción de ARN de isotiocianato de guanidio (Tabla de Materiales). Utilice 1 μg de ARNm para realizar la transcripción inversa utilizando hexámeros aleatorios con un kit comercial (Tabla de materiales).NOTA: Se puede utilizar cualquier método de extracción de ARN o síntesis deADNc 9,23,24. Congelar el ADNc a -20 °C hasta el análisis de la expresión génica. Evaluación del reordenamiento citoesquelético en células NK estimuladas por FcγRIIIa Después del último lavado con medios helados (paso 2.8), vuelva a colocar el pellet celular con 50 μL de paraformaldehído al 3,7% durante 10 min a RT. Agregue 1 ml de PBS y gire a 135 x g durante 5 minutos en RT. Repita este lavado una vez más. Añadir 100 μL de Tritón X-100/PBS al 0,1% durante 5 min para permeabilizar las células, y girar las células a 135 x g durante 5 min en RT al pellet. Añadir 100 μL de 5 unidades/ml de faloidina etiquetada con AF488 diluida en BSA/PBS al 1% e incubar durante 20 min a RT. Agregue 1 ml de PBS y gire a 135 x g durante 5 minutos en RT para lavar. Resuspend el pellet celular en el volumen deseado para el análisis citométrico de flujo. Evaluación de la degranulación de células NK estimuladas por FcγRIIIa mediante tinción superficial CD107a Incubar las células con el anticuerpo de interés en hielo como se describe en los pasos 2.1-2.4. Durante la incubación, prepare 50 μL de mezcla de anticuerpos por muestra. Preparar la mezcla en medios celulares con una concentración final de 50 μg/mL de anticuerpos de cadena ligera antihumanos κ y 1 μg/mL de CD107a marcado con fluorocromo. Después de la incubación de las células en hielo, agregue 1 ml de medios helados. Girar a 135 x g durante 5 min a 4 °C, luego lavar de nuevo con 1 ml de medios helados. Aspire el sobrenadante después del último lavado, luego agregue 50 μL de la mezcla de cadena ligera antihumana κ e incube a 37 ° C para los puntos de tiempo deseados. En los puntos de tiempo deseados, agregue 1 ml de PBS y gire a 135 x g durante 5 min en RT. Aspire sobrenadante y agregue 100 μL de paraformaldehído al 4%. Incubar en RT durante 10 min. Agregue 1 ml de PBS y gire a 135 x g durante 5 minutos en RT para lavar. Resuspend el pellet celular en el volumen deseado para el análisis citométrico de flujo. Evaluación de la producción de quimiocinas/citoquinas a partir de células NK estimuladas por FcγRIIIaNOTA: Se pueden utilizar diferentes métodos y/o kits para la evaluación de la producción de quimiocinas y citoquinas. Una vez alcanzado el punto de tiempo para la estimulación (paso 2.7), coloque inmediatamente el tubo sobre hielo y gire en una centrífuga refrigerada a 135 x g durante 5 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un recipiente limpio. Congele el sobrenadante hasta la evaluación de quimiocinas o citoquinas utilizando el ensayo deseado.NOTA: Los gránulos celulares ahora se pueden lavar con PBS helado y procesarse para estudios de señalización, expresión génica y reordenamiento citoesquelético.

Representative Results

Es esencial que la pureza de las células NK sea alta porque la porción Fc de los anticuerpos puede unirse a la FcγRIIIa expresada en otros tipos de células, como los monocitos. Con alta pureza, las observaciones realizadas se pueden atribuir directamente a eventos impulsados por FcγRIIIa en células NK. Aquí, las células NK tenían una pureza superior al 90% basada en tinciones CD56 y CD3(Figura 1). Además, la viabilidad fue del >95%. Se debe tener cuidado al usar aislamientos con menor viabilidad. Para garantizar que los eventos fueran impulsados por el FcγRIIIa, se realizaron western blots para fosfo-AKT (pAKT), fosfo-PRAS40 (pPRAS40) y fosfo-ERK1/2 (pERK1/2), en los que las células NK se activaron durante 1-5 min. Como se muestra, se observó una acumulación de estas moléculas(Figura 2). Del mismo modo, las células NK activadas expresaron MIP-1α, MIP-1β, IFN-γ y TNF-α, como se muestra en el análisis de expresióngénica (Figura 3). Adicionalmente, se observó reordenamiento citoesquelético en células activadas (Figura 4). Un porcentaje de células NK estimuladas durante 4 h expresó CD107a en la superficie celular (Figura 5). Además, se detectaron IFN-γ, TNF-α, MIP-1α, MIP-1β y RANTES en el sobrenadante después de 3 h de estimulación (Figura 6). Estas lecturas se esperan en base a estudios publicados ya que las células NK activadas tendrán estas proteínas fosforiladas, así como la expresión génica y la producción de las quimiocinas y citoquinas mencionadas8,9. En todos los experimentos, las condiciones de estimulación deben incluir un control de cadena ligera κ antihumana y un anticuerpo sin control de reticulación de luz κ antihumano. Estas células NK no deben mostrar ninguna fosfo-señalización, degranulación, producción de quimiocinas/citoquinas, o expresión génica de quimiocinas/citoquinas. Figura 1: Perfiles de flujo representativos de la pureza de las células NK después del aislamiento de pbMCs. Los PBMC se aislaron de la sangre de un donante sano, seguidos de un enriquecimiento de células NK utilizando un método de selección negativa para el aislamiento de células NK humanas(Tabla de Materiales). Las células se tiñeron con CD56 y CD3 antes y después del enriquecimiento para determinar la pureza. Diagramas de puntos representativos de CD56 vs. CD3 antes y después del aislamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Las células NK activadas por FcγRIIIa exhiben moléculas de señalización fosforiladas. Las células se estimularon con rituximab durante 2 min, y los lisados celulares se hicieron de acuerdo con el protocolo. Los lisatos se separaron en un gel de 4% a 12%, seguido de la transferencia a una membrana de PVDF. La membrana fue sondeada con anticuerpos contra pAKT, pPRAS40, pERK1/2 y actina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Las células NK activadas por FcγRIIIa expresan genes de quimiocinas y citoquinas. Las células NK fueron estimuladas con rituximab durante 0 h, 0,5 h y 1 h. Se recolectó ARNm, se transcribió inversamente y se sometió a análisis de qPCR para MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IFN-γ y TNF-α(Tabla de Materiales). (A) Expresión relativa de MIP-1α, MIP-1β y RANTES en cada punto temporal. (B) Expresión relativa de IFN-γ y TNF-α en cada punto de tiempo. Los valores se normalizaron al gen de la actina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Las células NK activadas por FcγRIIIa exhiben reordenamiento citoesquelético. Las células NK fueron estimuladas con rituximab durante 0 min, 5 min, 15 min y 30 min, seguido de una evaluación para el reordenamiento citoesquelético por tinción de faloidina y citometría de flujo. La relación de la IMF en el punto de tiempo experimental a la IMF en el tiempo 0 de las células NK estimuladas con rituximab (círculo, línea sólida) o anticuerpo secundario solo (línea cuadrada, punteada). Las barras representan la SD de cuatro réplicas. Los asteriscos representan la significación estadística basada en una prueba t de Student de dos colas no emparejada (*p < 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Las células NK activadas por FcγRIIIa expresan CD107a. Las células NK fueron estimuladas con rituximab durante 4 h, seguidas de una evaluación para la degranulación por CD107a y citometría de flujo. (A) Porcentaje de células NK que expresan CD107a después de la estimulación con rituximab (barras blancas) o anticuerpo de cadena ligera anti-humano κ (barras grises) durante 0 h y 4 h. (B) CD107a MFI de células NK estimuladas con rituximab (barras blancas) o anticuerpo de cadena ligera κ antihumano (barras grises) después de 0 h y 4 h de tratamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Las células NK activadas por FcγRIIIa secretan quimiocinas y citoquinas. Las células NK fueron estimuladas durante 0, 0,5, 1, 3 y 6 horas con rituximab. El sobrenadante se recolectó para medir la liberación de MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IFN-γ y TNF-α mediante un método de evaluación de citoquinas basado en flujo y perlas(Tabla de Materiales). (A) Producción de MIP-1α, MIP-1β y RANTES en cada punto de tiempo. (B) La producción de IFN-γ y TNF-α en cada punto de tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Este protocolo describe métodos para estudiar los eventos impulsados por FcγRIIIa en células NK mediadas por anticuerpos. Estas técnicas permiten la evaluación de posibles mecanismos de acción de anticuerpos terapéuticos, que se sugiere que es ADCC1,2. Específicamente, estos métodos proporcionan flexibilidad en el estudio de las vías de señalización molecular subyacentes y los procesos celulares que son responsables de ADCC. También permiten la observación de otras funciones efectoras, como la producción de quimiocinas y citoquinas. Además, estos métodos permiten la identificación de biomarcadores y moléculas potenciales que pueden ser dirigidos para modular ADCC.

La base de este protocolo es la estimulación artificial de las células NK a través del FcγRIIIa con anticuerpos en ausencia de células diana. Las células diana unidas a anticuerpos generalmente sirven para promover la reticulación de los receptores Fc para formar una plataforma que impulse la señalización y los efectos posteriores. En cambio, la reticulación se logra utilizando un anticuerpo de cadena ligera κ antihumano en este ensayo, evitando la necesidad de que las células diana estimulen las células NK. Sin células diana, los resultados y observaciones se pueden atribuir directamente a las células NK, suponiendo que el proceso de purificación sea exitoso.

Es importante destacar que el uso de anticuerpos de cadena ligera κ antihumanos para reticular el anticuerpo no interfiere con la afinidad de unión de la porción Fc para el FcγRIIIa, una interacción que dicta la fuerza de la respuesta10,11,12,13. De hecho, los estudios han demostrado que los anticuerpos afucosilados aumentan el ADCC debido a su mayor afinidad por el FcγRIIIa10,11,12,13. Estudios posteriores mostraron que este aumento de la afinidad no se ve afectado por el sustituto secundario de anticuerpos de cadena ligera κ antihumano y puede usarse para estudiar la base para el aumento de ADCC8. Para garantizar que la célula NK se estimule a través de la reticulación del anticuerpo, se deben incluir dos controles negativos: 1) anticuerpo terapéutico solo sin el anticuerpo secundario de cadena ligera anti-humano κ, y 2) el anticuerpo secundario anti-humano κ cadena ligera solamente. En ambos casos, no se debe generar ninguna función de señalización o efector.

Este método también proporciona flexibilidad para estudiar los efectos de los anticuerpos terapéuticos en los inhibidores de moléculas pequeñas. El inhibidor se puede agregar antes de la reticulación con el anticuerpo secundario para que el inhibidor tenga tiempo de comprometer su objetivo. Sin embargo, se deben realizar estudios para determinar el momento óptimo del pretratamiento con inhibidores; por lo tanto, el inhibidor tiene un efecto máximo sobre la estimulación. Dicho esto, los investigadores también pueden optar por estudiar los efectos de un inhibidor después de la estimulación. En este caso, el inhibidor se puede agregar después de la reticulación para estudiar cómo influye en las señales y procesos que ya se generan. En conjunto, el método descrito aquí proporciona la máxima flexibilidad en el estudio de los efectos combinatorios de diferentes inhibidores de moléculas pequeñas con anticuerpos terapéuticos.

Como se mencionó anteriormente, se puede realizar una variedad de lecturas después de la estimulación. Western blotting se puede realizar para estudiar la señalización utilizando SDS-PAGE y sistemas de transferencia de membrana de varios proveedores. Del mismo modo, la expresión génica también se puede evaluar utilizando varios métodos de extracción de ARN, reactivos de transcripción inversa e instrumentos de expresión génica. Finalmente, también se puede realizar tinción de proteínas intracelulares o extracelulares en las que se pueden analizar muestras utilizando diferentes citómetros de flujo. Para la tinción de citoquinas intracelulares y CD107a (paso 3.4, que se puede evaluar simultáneamente), se debe agregar monensina y / o brefeldina A para maximizar las señales. Hemos utilizado diferentes plataformas para cada objetivo experimental y aún así observamos resultados similares. Por lo tanto, el método se puede complementar con varios reactivos, plataformas e instrumentos, dependiendo del estudio.

El tiempo de reticulación para la estimulación dependerá del objetivo del estudio. Si se desean estudios de señalización, el tiempo típico de estimulación de reticulación es de entre 2 min y 10 min. La acumulación de pAKT, pPRAS40 y pERK1/2 alcanza su punto máximo a los 2 min y desaparece después de 10 min8,9. Para los estudios funcionales (es decir, aquellos que involucran la producción de quimiocinas / citoquinas), las células deben estimularse durante al menos 30 min, dependiendo del analito9. El análisis de la expresión génica también suele ser típicamente requiere 30 min de estimulación9. Se debe tener precaución al usar la expresión del gen RANTES como lectura, ya que la producción de ARNm RANTES es independiente de la activación transcripcional, ya que ya está almacenada en las células para una rápida traducción y liberación de proteínas tras la estimulación25. La degranulación, por el contrario, requiere al menos 3 h de estimulación. A pesar de estas observaciones generales, los investigadores deben realizar estudios cinéticos para determinar el tiempo óptimo de estimulación para las moléculas particulares de interés.

Del mismo modo, los investigadores deben valorar el anticuerpo de interés para determinar la concentración óptima porque los anticuerpos con diferentes especificidades se unen a FcγRIIIa con diferentes afinidades, incluso si son del mismo isotipo. Por ejemplo, rituximab y trastuzumab son ambos un isotipo igG1 pero trastuzumab se une más fuertemente al polimorfismo valina de FcγRIIIa que rituximab26,27. Esta diferencia de afinidad puede dar lugar a diferencias funcionales, como la degranulación, como se observa en estudios publicados8.

Determinar la concentración óptima también es importante debido a la baja afinidad que la porción Fc del anticuerpo tiene por el FcγRIIIa. Esto puede resultar en el lavado del anticuerpo, ya que el protocolo incluye pasos de lavado después de la unión del anticuerpo al receptor Fc. Esto puede conducir a una falta de sensibilidad en los ensayos, como lo sugiere el bajo porcentaje de células CD107a positivas después de la estimulación (Figura 5). Sin embargo, la determinación de la concentración óptima debe proporcionar confianza en que los resultados no se deben a una falta de sensibilidad. Además, las células se activan claramente en los ensayos bioquímicos y funcionales que utilizan células a granel en lugar de lecturas de células individuales(Figura 2, Figura 3, Figura 6).

El protocolo también es limitado ya que no imita completamente lo que ocurre fisiológicamente. El anticuerpo K antihumano secundario utilizado es para imitar la reticulación generada por el antígeno objetivo expresado en las células. Aquí, se agrega una cantidad saturada de anticuerpos secundarios para generar la respuesta máxima. Sin embargo, distintas células diana expresarán diferentes niveles de antígeno, lo que afectará la reticulación y la respuesta. Actualmente, esta plataforma no está optimizada para imitar los efectos de diferentes niveles de expresión de antígenos.

Otro factor a considerar al realizar estos experimentos es la variabilidad de donante a donante debido a los diferentes antecedentes genéticos e historias inmunológicas entre los individuos. Por lo tanto, se debe tener cuidado al comparar las respuestas de las células NK de diferentes donantes en los mismos ensayos. Del mismo modo, sólo se deben sacar conclusiones generales cuando se utilizan diferentes donantes.

En conjunto, el método descrito es una plataforma de estimulación simple y flexible para estudiar eventos mediados por FcγRIIIa impulsados por anticuerpos en células NK. Se ha utilizado para comprender mejor las bases del aumento de ADCC y la eficacia observada con anticuerpos afucosilados8. Este método también se empleó en un estudio que combinó anticuerpos terapéuticos e inhibidores de moléculas pequeñas PI3K9. Adicionalmente, se identificó un mecanismo previamente desconocido para la producción de quimiocinas y citoquinas regulado por pS69. Por lo tanto, los estudios futuros que utilizan esta plataforma de señalización artificial pueden dilucidar aún más los mecanismos de regulación de las funciones efectoras impulsadas por el FcγRIIIa. También puede identificar potencialmente nuevas moléculas importantes para estos mecanismos, así como nuevas funciones para moléculas conocidas.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a James Lee y Christopher Ng por los comentarios y la edición de este manuscrito.

Materials

16% paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 50-980-487
Alexa Fluor 488 phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
anti-mouse HRP antibody Cell Signaling Technologies 7076
AutoMACS instrument Miltenyi NK cell isolation method; another isolation instrument may be used
B-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023
Bovine Serum Albumin Fraction V, fatty acid free Millipore Sigma 10775835001
CD107a APC antibody Biolegend 328620
Cytokine 30-Plex Human Panel Thermo Fisher Scientific LHC6003M chemokine/cytokine method; another chemokine/cytokine analysis method may be used
FBS Hyclone SH30071.01
Goat anti-human κ light chain antibody Millipore Sigma AP502
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail Thermo Fisher Scientific 78440
HEPES Thermo Fisher Scientific 15630080
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific 4368814 cDNA transcription method; used according to manufacturer's protocol
IFN-ɣ primers Thermo Fisher Scientific Hs00989291_m1
Leukosep tube (50 ml conical with porous barrier) Greiner 227290
Lymphoprep (density gradient medium) Stemcell 7851
MIP-1⍺ primers Thermo Fisher Scientific Hs00234142_m1
MIP-1β primers Thermo Fisher Scientific Hs99999148_m1
NK cell isolation kit Miltenyi 130-092-657 NK cell isolation kit; another isolation kit may be used
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher Scientific another protein separation system may be used
pAKT (S473) antibody Cell Signaling Technologies 4060
pERK1/2 antibody Cell Signaling Technologies 4370
pPRAS40 antibody Cell Signaling Technologies 13175
PVDF membrane Thermo Fisher Scientific nitrocellulose may be used
RANTES primers Thermo Fisher Scientific Hs00982282_m1
RIPA buffer Millipore Sigma R0278
RPMI w/glutamax Thermo Fisher Scientific 61870
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360070
TNF-⍺ primers Thermo Fisher Scientific Hs00174128_m1
Triton X-100 Thermo Fisher Scientific 85111
TRIzol Thermo Fisher Scientific 15596018 RNA isolation method; used according to manufacturer's protocol
Xcell Blot II Transfer Module Thermo Fisher Scientific another protein separation system may be used
Xcell SureLock Protein Gel Electrophoresis Chamber System Thermo Fisher Scientific another protein separation system may be used
β-actin HRP antibody Abcam ab6721
β-actin primers Thermo Fisher Scientific Hs00982282_m1
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References

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Petriello, A., Becerra, J. A., Lay, J., Husaini, R., Windler, S. L., Duramad, O., Liu, S. D. Assessment of Human Natural Killer Cell Events Driven by FcγRIIIa Engagement in the Presence of Therapeutic Antibodies. J. Vis. Exp. (159), e61144, doi:10.3791/61144 (2020).
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