Analisi citometrica del flusso dell'infiltrazione di linfociti nel sistema nervoso centrale durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Come una malattia cronica demistelinating del SNC, MS colpisce circa 2,5 milioni di persone in tutto il mondo e manca di trattamenti curativi¹. È anche considerata una malattia autoimmune, in cui i linfociti T specifici dell’antigene mielina avviano una reazione infiammatoria e portano alla demelinazione e alle lesioni assonali nel SNC². L’encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è stata ampiamente utilizzata per studiare i meccanismi patogeni della SM come un classico modello di malattia di demyelination autoimmune in CNS³. Ci sono due modi per indurre EAE: uno è quello di indurre EAE attivamente immunizzando gli animali con componenti mielin, un altro è il trasferimento adottivo trasferendo le cellule T encefalogeniche nel^{recettore 2,4,5}. Le suscettibilità a EAE sono diverse in diversi ceppi animali⁶. Nei topi C57BL/6, la glicoproteina mielina oligodendrocite (MOG) 35-55 induce una malattia monofasica con estatissima demelinazione e infiammazione nel SNC, che viene spesso utilizzata negli esperimenti con topi gene-mirati⁷.

La generazione di cellule T reattive specifiche della mielina è necessaria per l’insorgenza e lo sviluppo della malattia nell’EAE ed è un segno immunologico sia di EAE che di SM. I linfociti T autoreattivi attivati attraversano la barriera ematica del cervello (BBB) nel SNC sano e avviano la malattia EAE. Quando si incontra MOG 35-55 Ag, questi linfociti T inducono infiammazione e il reclutamento di cellule estruse nel SNC, con conseguente demielinazione e distruzione dell’assone^8,9. Nel modello EAE, ci sono ampie prove che le cellule CD4 specifiche del neuroantigeno^possono avviare e sostenere la neuroinfiammazione e la^{patologia 3,10}. A seconda delle principali citochine prodotte, i linfociti^CD4 e T sono stati classificati in diversi sottoinsiemi: Th1 (caratterizzato dalla produzione di interferone-γ), Th2 (caratterizzato dalla produzione di interleuchina 4) e Th17 (caratterizzato dalla produzione di interleuchina 17). Si ritiene che l’attivazione delle cellule Th1 e Th17 contribuisca all’induzione, al mantenimento e alla regolazione della demistelinazione infiammatoria in EAE e MS secernendo le citochine effettore IFN-γ e IL-17, che sono in grado di attivare macrofagi e reclutare neutroni nei siti infiammatori per accelerare le lesioni¹¹.

Poiché le cellule T autoreattive attraversano il BBB nel SNC e inducono lo sviluppo della malattia nella SM e nell’EAE, è molto importante analizzare le cellule T nel SNC. Tuttavia, ci sono pochissimi protocolli stabiliti per l’isolamento dei linfociti dal CNS¹². Pertanto, è stato sviluppato un metodo ottimizzato per isolare le cellule mononucleari dal cervello e analizzare i linfociti T con marcatori CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g e IL-17 per la citometria di flusso. Il metodo utilizza MOG35-55 adiuvante Mycobacterium tuberculosis H37 Ra e Pertussis Toxin Working Solution (PTX) per indurre un modello di immunizzazione attiva di EAE nei topi. Quindi, i metodi di separazione meccanica e di centrifugazione del gradiente di densità vengono utilizzati per l’isolamento delle cellule mononucleari CNS. Infine, viene utilizzata una strategia ottimizzata di gating della citometria del flusso per identificare i linfociti T e i sottoinsiemi dal cervello colorando più marcatori.