Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Merkezi Sinir Sisteminde Lenfosit Infiltrasyonunun Akış Sitometrik Analizi
Summary
Bu el yazması farelerde aktif deneysel deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) indüklemek için bir protokol sunar. Merkezi sinir sisteminde (CNS) infiltrasyon lenfositlerin izolasyon ve karakterizasyonu için bir yöntem de lenfositler CNS otoimmün hastalığın gelişiminde nasıl rol olduğunu göstermek için sunulmaktadır.
Abstract
Multipl skleroz (MS), çevresel faktörler ve duyarlı genetik arka planın birleşimi ile oluşan merkezi sinir sisteminin (CNS) otoimmün bir hastalığıdır. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), Miyelin antijenlerine özgü T lenfositlerinin CNS’de inflamatuar reaksiyon başlattığı patogenezi araştırmak için yaygın olarak kullanılan tipik bir MS hastalığı modelidir. CNS lenfositler hastalığın gelişimini nasıl düzenleyen değerlendirmek için çok önemlidir. Ancak, CNS’de infiltrasyonlu lenfositlerin miktarını ve kalitesini ölçme yaklaşımı, beyinden sızmış lenfositlerin izole edilmesi ve saptanmasındaki güçlükler nedeniyle çok sınırlıdır. Bu el yazması, CNS’den infiltrasyona geçen lenfositlerin izolasyonu, tanımlanması ve karakterizasyonu için yararlı olan bir protokol sunar ve lenfositlerin CNS otoimmün hastalığının gelişiminde nasıl rol aldığını anlamamıza yardımcı olacaktır.
Introduction
CNS kronik bir demiyelinating hastalık olarak, MS dünya çapında yaklaşık 2,5 milyon kişi etkiler ve küratif tedavileryoksun 1. Ayrıca bir otoimmün hastalık olarak kabul edilir, hangi miyelin antijen spesifik T lenfositler inflamatuar bir reaksiyon başlatmak ve CNS demiyelinasyon ve aksonal yaralanmaya yol2. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) yaygın CNS bir klasik otoimmün demiyelinasyon hastalığı modeli olarak MS patojenik mekanizmaları araştırmak için kullanılmıştır3. EAE ikna etmek için iki yolu vardır: bir miyelin bileşenleri ile hayvanlar aşılayarak aktif EAE ikna etmektir, başka reseptöriçineensefalojenik T hücreleri aktararak benimseyen transfer 2,4,5. EAE duyarlılıkları farklı hayvan suşları farklıdır6. C57BL/6 farelerinde, myelin oligodendrocyte glikoprotein (MOG) 35-55 sorun cns geniş demiyelinasyon ve inflamasyon ile monophasik bir hastalığa neden olur, sık sık gen hedefli fareler ile deneylerde kullanılan7.
EAE’de hastalığın oluşumu ve gelişimi için miyelinspesifik reaktif T hücrelerinin üretimi gereklidir ve hem EAE hem de MS. Aktif otoreaktif T lenfositlerinin sağlıklı CNS’ye kan beyin bariyerini (BBB) geçmelerinin ve EAE hastalığının başlatılmasının immünolojik bir işaretidir. MOG 35-55 Ag karşılaştığında, Bu T lenfositler inflamasyon ve CNS içine efektör hücrelerin işe neden, demiyelinasyon ve akson yıkımı ile sonuçlanan8,9. EAE modelinde, nöroantijene özgü CD4+ T hücrelerinin nöroinflamasyon vepatolojiyibaşlatabildiği ve sürdürebileceğine dair yeterli kanıt vardır 3,10. Üretilen majör sitokinlere bağlı olarak, CD4+ T lenfositler farklı alt kümelere sınıflandırılmıştır: Th1 (interferon-γ üretimi ile karakterize), Th2 (interlökin üretimi ile karakterize 4), ve Th17 (interlökin üretimi ile karakterize 17). Bu Th1 ve Th17 hücrelerinin aktivasyonu indüksiyon katkıda olduğuna inanılmaktadır, bakım, ve EAE ve MS inflamatuar demiyelinasyon düzenlenmesi etki edici sitokinler IFN-γ ve IL-17 salgılayarak, hangi makrofajlar aktive yeteneğine sahip ve lezyonları hızlandırmak için inflamatuar sitelere nötrofiller işe11.
Otoreaktif T hücreleri BBB’yi CNS’ye geçtiği nden ve MS ve EAE’de hastalığın gelişmesine neden olduğundan, CNS’deki T hücrelerini analiz etmek çok önemlidir. Ancak, CNS12lenfositlerin izolasyonu için çok az kurulmuş protokoller vardır. Bu nedenle, beyinden mononükleer hücreleri izole etmek ve t lenfositleri cd45, CD11b, CD3, CD4, INF-g ve IL-17 ile analiz etmek için optimize edilmiş bir yöntem geliştirilmiştir. Yöntem farelerde EAE aktif bir bağışıklama modeli neden MOG35-55 adjuvan Mycobacterium tuberculosis H37 Ra ve Pertussis Toksin Çalışma Solüsyonu (PTX) kullanır. Daha sonra CNS mononükleer hücrelerin izolasyonu için mekanik ayırma ve yoğunluk gradyan santrifüj yöntemleri kullanılır. Son olarak, bir optimize akış sitometri gating stratejisi birden fazla belirteçleri boyama tarafından beyinden T lenfositler ve alt kümeleri tanımlamak için kullanılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, MS. EAE’nin tipik bir nöroimmünolojik deneysel hayvan modeli olarak kabul edilen C57BL/6 farelerinde MOG35-55 kullanarak EAE’yi indüklemek ve izlemek için bir protokol sunmaktadır. Örneğin, SJL farelerde PLP139-151 peptid kullanarak özelliklerelaps15terapötik etkileri değerlendirmek için uygun bir nüks-remitting EAE hastalığı ders neden olabilir. Burada özetlenen deneysel prosedür diğer EAE protokollerine de uygulanabilir7. Bu modelde C57BL/…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı hibe (31570921 ZJ, 81571533 LS), Şangay Belediye Sağlık Komisyonu ve Aile Planlaması (201540206 ZJ), Ruijin Hastanesi Kuzey araştırma hibe (2017ZX01 ZJ) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
References
- Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
- Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).
- Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
- Lassmann, H., Wisniewski, H. M. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis. Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).
- Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).
- Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein. Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
- Bramow, S., et al. Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis. Brain. 133, 2983-2998 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R. Immunology of multiple sclerosis. Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).
- McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).
- Ji, Z., et al. Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2. Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).
- Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).
- Ji, Z., et al. Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration. Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).
- Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).
- Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).
