実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系におけるリンパ球浸潤のフロー細胞量分析

CNSの慢性脱髄疾患として、MSは世界中で約250万人に影響を及ぼし、治癒的治療を欠いている¹.また、自己免疫疾患と考えられ、その中でミエリン抗原特異的Tリンパ球が炎症反応を起こし、CNS2において脱髄および軸索損傷を引き起こす。²実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、CNS3における古典的な自己免疫脱髄疾患モデルとしてMSの病原性メカニズムを調査するために広く使用されてきた³。EAEを誘導する方法は2つあり、1つはミエリン成分で動物を免疫することによってEAEを積極的に誘導し、もう1つは脳原性T細胞を受容体^{22、4、54,5}に移すことによって養子転移することである。EAEへの感受性は、異なる動物株⁶で異なっている。C57BL/6マウスにおいて、ミエリンオリゴデンドロキ酸糖タンパク質(MOG)35~55チャレンジは、CNSにおける広範な脱髄および炎症を伴う単相性疾患を誘発し、遺伝子標的マウスの実験で頻繁に使用される^7。

ミエリン特異的反応性T細胞の生成は、EAEにおける疾患の発生および発症に必要であり、EAEおよびMS.活性化自己反応性Tリンパ球が血液脳関門(BBB)を健康なCNSに横断し、EAE疾患を開始する免疫学的徴候である。MOG 35-55 Agが発生すると、これらのTリンパ球は炎症を誘発し、CNSにエフェクター細胞を動員し、脱髄および軸索破壊^88,99を生じる。EAEモデルでは、神経抗原特異的^CD4+T細胞が神経炎症および病理^3,3,10を開始し、持続することができるという十分な証拠がある。産生される主要なサイトカインに応じて^、CD4+Tリンパ球は異なるサブセットに分類されている:Th1(インターフェロンγの産生によって特徴付けられる)、Th2(インターロイキン4の産生によって特徴付けられる)、およびTh17(インターロイキン17の産生によって特徴付けられる)。Th1およびTh17細胞の活性化は、マクロファージを活性化し、^病変を加速させるために炎症性部位に好中球を求めることができるエフェクターサイトカインIFN-γおよびIL-17を分泌することにより、EAEおよびMSにおける炎症性脱髄の誘導、維持、および調節に寄与すると考えられている。

自己反応性T細胞は、CNSにBBBを横断し、MSおよびEAEにおける疾患の発症を誘導するので、CNS内のT細胞を分析することは非常に重要である。しかし、CNS¹²からリンパ球を単離するための確立されたプロトコルはほとんどありません。そこで、単核細胞を脳から単離し、Cd45、CD11b、CD3、CD4、INF-g、およびIL-17のフローサイトメトリーを用いてTリンパ球を解析するための最適化された方法を開発した。この方法では、MOG35-55アジュバント結核 菌 H37 Raおよびペルタシス毒素ワーキングソリューション(PTX)を用いて、マウスにおけるEAEの活性免疫モデルを誘導する。そして、CNS単核細胞の単一核細胞の単離に機械的分離及び密度勾配遠心分離法が用いられる。最後に、最適化されたフローサイトメトリー測定の測定戦略を使用して、複数のマーカーを染色することによって脳からTリンパ球およびサブセットを同定する。