Análise Citométrica de Fluxo de Infiltração linfócito no Sistema Nervoso Central durante Encefalomielite Autoimune Experimental

Como doença desmielinizante crônica do SNC, a ESM afeta cerca de 2,5 milhões de pessoas em todo o mundo e carece de tratamentos curativos¹. Também é considerada uma doença autoimune, na qual linfócitos T específicos de mielina iniciam uma reação inflamatória e levam à desmielinização e lesão axila no CNS². A encefalomielite autoimune experimental (EAE) tem sido amplamente utilizada para investigar mecanismos patogênicos da ESM como um modelo clássico de doença desmielinização autoimune no CNS³. Existem duas maneiras de induzir o EAE: uma é induzir o EAE ativamente imunizando animais com componentes de mielina, outra é a transferência adotiva transferindo células T encefalitárias para o receptor^2,,4,,5. As suscetibilidades à EAE são diferentes em diferentes cepas animais⁶. Em camundongos C57BL/6, o desafio de mielina oligodendrocyte glicoproteína (MOG) 35-55 induz uma doença monofásica com desmielinização extensiva e inflamação no CNS, que é frequentemente usado em experimentos com camundongos direcionados a genes⁷.

A geração de células T reativas específicas da mielina é necessária para a ocorrência e desenvolvimento da doença na EAE e é um sinal imunológico tanto da EAE quanto da EAE. Linfócitos T autoretivos ativados cruzam a barreira cerebral sanguínea (BBB) para a doença saudável do CNS e iniciam a doença da EAE. Quando o MOG 35-55 Ag é encontrado, esses linfócitos T induzem inflamação e o recrutamento de células effectoras para o CNS, resultando em desmielinização e destruição de axônio^8,,9. No modelo EAE, há amplas evidências de que as células CD4⁺ T específicas do neuroantígeno podem iniciar e sustentar neuroinflamação e patologia^3,,10. Dependendo das principais citocinas produzidas, os linfócitos CD4⁺ T foram classificados em diferentes subconjuntos: Th1 (caracterizado pela produção de interferon-γ), Th2 (caracterizado pela produção de interleucina 4) e Th17 (caracterizado pela produção de interleucina 17). Acredita-se que a ativação das células Th1 e Th17 contribuam para a indução, manutenção e regulação da desmielinização inflamatória na EAE e MS, secretando os efeitos IFN-γ e IL-17, capazes de ativar macrófagos e recrutar neutrófilos para os locais inflamatórios para acelerar as lesões¹¹.

Como as células T autoativas cruzam o BBB para o CNS e induzem o desenvolvimento da doença em MS e EAE, é muito importante analisar as células T no SNC. No entanto, há muito poucos protocolos estabelecidos para o isolamento de linfócitos do CNS¹². Por isso, foi desenvolvido um método otimizado para isolar células mononucleares do cérebro e analisar linfócitos T com marcadores CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g e IL-17 para citometria de fluxo. O método utiliza o MOG35-55 adjuvante Mycobacterium tuberculosis H37 Ra and Pertussis Toxin Working Solution (PTX) para induzir um modelo ativo de imunização de EAE em camundongos. Em seguida, métodos de centrifugação de gradiente de separação mecânica e densidade são usados para o isolamento de células mononucleares CNS. Finalmente, uma estratégia otimizada de citometria de fluxo é usada para identificar linfócitos T e subconjuntos do cérebro, manchando vários marcadores.