Análisis citométrico de flujo de infiltración de linfocitos en el sistema nervioso central durante la encefalomielitis autoinmune experimental

Como enfermedad desmielinizante crónica del SNC, la SME afecta a unos 2,5 millones de personas en todo el mundo y carece de tratamientos curativos¹. También se considera una enfermedad autoinmune, en la que los linfocitos T específicos del antígeno de mielina inician una reacción inflamatoria y conducen a la desmielinización y lesión axonal en el SNC^2. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) se ha utilizado ampliamente para investigar mecanismos patógenos de la EME como un modelo clásico de la enfermedad de desmielinización autoinmune en el SNC³. Hay dos maneras de inducir EAE: una es inducir EAE activamente inmunizando animales con componentes de mielina, otra es la transferencia adoptiva mediante la transferencia de células T encefalitgénicas al receptor^2,4,5. Las susceptibilidades a EAE son diferentes en diferentes cepas animales⁶. En ratones C57BL/6, el desafío de la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG) 35–55 induce una enfermedad monofásica con desmielinización e inflamación extensas en el SNC, que se utiliza con frecuencia en experimentos con ratones dirigidos a genes⁷.

La generación de células T reactivas específicas de mielina es necesaria para la aparición y el desarrollo de la enfermedad en EAE y es un signo inmunológico de EAE y MS. Los linfocitos T autoreactivos activados cruzan la barrera hematoencefálica (BBB) hacia el SNC sano e inician la enfermedad de EAE. Cuando se encuentra MOG 35–55 Ag, estos linfocitos T inducen inflamación y el reclutamiento de células efectores en el SNC, lo que resulta en desmielinización y destrucción de axones^8,,9. En el modelo EAE, hay una amplia evidencia de que las células CD4⁺ T específicas de neuroantigen pueden iniciar y sostener la neuroinflamación y la patología^3,,10. Dependiendo de las principales citoquinas producidas, los linfocitos CD4⁺ T se han clasificado en diferentes subconjuntos: Th1 (caracterizado por la producción de interferón-γ), Th2 (caracterizado por la producción de interleucina 4), y Th17 (caracterizado por la producción de interleucina 17). Se cree que la activación de las células Th1 y Th17 contribuyen a la inducción, mantenimiento y regulación de la desmielinización inflamatoria en EAE y EM mediante el secretamiento de las citoquinas efectoras IFN-γ e IL-17, que son capaces de activar macrófagos y reclutar neutrófilos a los sitios inflamatorios para acelerar las lesiones¹¹.

Debido a que las células T autorreactivas cruzan el BBB hacia el SNC e inducen el desarrollo de la enfermedad en la EMA y eas, es muy importante analizar las células T en el SNC. Sin embargo, hay muy pocos protocolos establecidos para el aislamiento de linfocitos del SNC^12. Por lo tanto, se desarrolló un método optimizado para aislar células mononucleares del cerebro y analizar linfocitos T con marcadores CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g e IL-17 para la citometría de flujo. El método utiliza la solución de trabajo Mycobacterium tuberculosis de toxinas de perersis (PTX) adyuvante MOG35–55 para inducir un modelo de inmunización activa de EAE en ratones. Luego, los métodos de separación mecánica y centrifugación de gradiente de densidad se utilizan para el aislamiento de células mononucleares del SNC. Por último, se utiliza una estrategia de medición de citometría de flujo optimizada para identificar linfocitos T y subconjuntos del cerebro mediante la tinción de múltiples marcadores.