Flow Cytometrische Analyse van lymfocyten infiltratie in het centrale zenuwstelsel tijdens experimentele auto-immuunenceomyelitis
Summary
Dit manuscript presenteert een protocol om actieve experimentele auto-immuunenceomyelitis (EAE) bij muizen te induceren. Een methode voor de isolatie en karakterisering van de geïnfiltreerde lymfocyten in het centrale zenuwstelsel (CNS) wordt ook gepresenteerd om te laten zien hoe lymfocyten betrokken zijn bij de ontwikkeling van cns auto-immuunziekte.
Abstract
Multiple sclerose (MS) is een auto-immuunziekte van het centrale zenuwstelsel (CNS) veroorzaakt door de combinatie van omgevingsfactoren en gevoelige genetische achtergrond. Experimentele auto-immuunenceomyelitis (EAE) is een typisch ziektemodel van MS dat op grote schaal wordt gebruikt voor het onderzoeken van de pathogenese waarbij T-lymfocyten specifiek voor myelineantigen een ontstekingsreactie in CNS initiëren. Het is zeer belangrijk om te beoordelen hoe lymfocyten in het CNS de ontwikkeling van de ziekte reguleren. Echter, de aanpak voor het meten van de hoeveelheid en de kwaliteit van geïnfiltreerde lymfocyten in het CNS is zeer beperkt als gevolg van de moeilijkheden bij het isoleren en detecteren van geïnfiltreerde lymfocyten uit de hersenen. Dit manuscript presenteert een protocol voor dat nuttig is voor de isolatie, identificatie en karakterisering van geïnfiltreerde lymfocyten uit het CNS en zal nuttig zijn voor ons begrip van hoe lymfocyten betrokken zijn bij de ontwikkeling van de CNS auto-immuunziekte.
Introduction
Als een chronische demyeliniserende ziekte van het CNS, MS treft ongeveer 2,5 miljoen mensen wereldwijd en mist curatieve behandelingen1. Het wordt ook beschouwd als een auto-immuunziekte, waarbij myeline-antigeenspecifieke T-lymfocyten een ontstekingsreactie initiëren en leiden tot demyelinatie en axonale schade in het CNS2. Experimentele auto-immuunenceomyelitis (EAE) is op grote schaal gebruikt om pathogene mechanismen van MS te onderzoeken als een klassiek auto-immuundemyeminatieziektemodel in CNS3. Er zijn twee manieren om EAE te induceren: een is om EAE actief te induceren door dieren te immuniseren met myeline componenten, een andere is adoptie-overdracht door het overbrengen van encefalogene T-cellen in receptor2,4,5. De gevoeligheden voor EAE zijn verschillend in verschillende dierlijke stammen6. In C57BL/6 muizen veroorzaakt myeline oligodendrocyte glycoproteïne (MOG) 35–55 uitdaging een monofasische ziekte met uitgebreide demyelinatie en ontsteking in het CNS, die vaak wordt gebruikt in experimenten met gengerichte muizen7.
De generatie van myeline-specifieke reactieve T-cellen is vereist voor het optreden en de ontwikkeling van de ziekte in EAE en is een immunologisch teken van zowel EAE als MS. Geactiveerde autoreactieve T-lymfocyten kruisen de bloedhersenbarrière (BBB) in het gezonde CZS en initiëren de ZIEKTE van EAE. Wanneer MOG 35–55 Ag wordt aangetroffen, veroorzaken deze T-lymfocyten ontstekingen en de rekrutering van effectorcellen in het CZS, wat resulteert in demyelinatie en axonvernietiging8,9. In het EAE-model is er voldoende bewijs dat neuroantigen-specifieke CD4+ T-cellen neuro-ontsteking en pathologie3,10kunnen initiëren en ondersteunen. Afhankelijk van de belangrijkste geproduceerde cytokinen zijn CD4+ T-lymfocyten ingedeeld in verschillende subsets: Th1 (gekenmerkt door de productie van interferon-γ), Th2 (gekenmerkt door de productie van interleukine 4) en Th17 (gekenmerkt door de productie van interleukine 17). Er wordt aangenomen dat activering van Th1- en Th17-cellen bijdraagt aan de inductie, het onderhoud en de regulering van ontstekingsdemyelinatie in EAE en MS door effectorcytokines IFN-γ en IL-17 te scheiden, die in staat zijn om macrofagen te activeren en neutrofielen te rekruteren voor de ontstekingssites om de laesies te versnellen11.
Omdat autoreactive T-cellen de BBB oversteken in het CZS en de ontwikkeling van ziekte bij MS en EAE veroorzaken, is het erg belangrijk om T-cellen in het CZS te analyseren. Er zijn echter zeer weinig protocollen voor de isolatie van lymfocyten uit het CNS12. Daarom is een methode ontwikkeld die is geoptimaliseerd voor het isoleren van mononucleaire cellen uit de hersenen en het analyseren van T-lymfocyten met markers CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g en IL-17 voor flow cytometrie. De methode maakt gebruik van MOG35–55 adjuvans Mycobacterium tuberculosis H37 Ra en Pertussis Toxine Working Solution (PTX) om een actief immunisatiemodel van EAE bij muizen te induceren. Vervolgens worden mechanische scheidings- en dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethoden gebruikt voor de isolatie van CNS mononucleaire cellen. Ten slotte wordt een geoptimaliseerde flow cytometrie gating strategie gebruikt om T lymfocyten en subsets uit de hersenen te identificeren door meerdere markers te beitsen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze studie presenteert een protocol voor het induceren en monitoren van EAE met behulp van MOG35-55 in C57BL/6 muizen, die worden beschouwd als een typisch neuroimmunologisch experimenteel diermodel van MS. EAE kan worden geïnduceerd variërend van de muizenstammen of het type eiwit dat wordt gebruikt voor inductie volgens het doel van de studie. Bijvoorbeeld, met behulp van PLP139-151 peptide bij SJL muizen kan leiden tot een relapsing-remitting EAE ziekte cursus die vooral goed geschikt is voor het beoordelen van the…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door De Nationale Toekenning van de Wetenschap van China (31570921 aan ZJ, 81571533 aan LS), De Gemeentelijke Commissie van Shanghai van Gezondheid, en De Planning van de familie (201540206 aan ZJ), Het onderzoekstoelage van het Ziekenhuis Ruijin Noord (2017ZX01 aan ZJ).
Materials
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
References
- Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
- Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).
- Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
- Lassmann, H., Wisniewski, H. M. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis. Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).
- Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).
- Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein. Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
- Bramow, S., et al. Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis. Brain. 133, 2983-2998 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R. Immunology of multiple sclerosis. Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).
- McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).
- Ji, Z., et al. Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2. Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).
- Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).
- Ji, Z., et al. Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration. Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).
- Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).
- Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).
