זרימה ניתוח ציטומטרי של חדירה לימפוציטים במערכת העצבים המרכזית במהלך אנצפלומיאלטיס אוטואימונית ניסיונית
Summary
כתב יד זה מציג פרוטוקול כדי לגרום אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית פעילה (EAE) בעכברים. שיטה לבידוד ואפיון של לימפוציטים הסתננו במערכת העצבים המרכזית (CNS) מוצגת גם כדי להראות כיצד לימפוציטים מעורבים בהתפתחות של מחלת החיסון האוטואימונית CNS.
Abstract
טרשת נפוצה (MS) היא מחלה אוטואימונית של מערכת העצבים המרכזית (CNS) הנגרמת על ידי שילוב של גורמים סביבתיים ורקע גנטי רגיש. אנצפלומיאלטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) הוא מודל מחלה טיפוסי של טרשת נפוצה בשימוש נרחב לחקירת הפתוגנזה שבה לימפוציטים T ספציפי לאנטיגנים מיאלינים ליזום תגובה דלקתית ב- CNS. חשוב מאוד להעריך כיצד לימפוציטים במערכת העצבים תסדיר את התפתחות המחלה. עם זאת, הגישה למדידת הכמות והאיכות של לימפוציטים חדרו ב-CNS מוגבלת מאוד בשל הקשיים בבידוד ואיתור לימפוציטים חדרו מהמוח. כתב יד זה מציג פרוטוקול לכך שימושי לבידוד, זיהוי, ואפיון של לימפוציטים הסתננו ממערכת העצבים הצרפתית ויהיה מועיל להבנתנו כיצד לימפוציטים מעורבים בפיתוח המחלה האוטואימונית CNS.
Introduction
כמחלה demyelinating כרונית של CNS, טרשת נפוצה משפיעה על 2.5 מיליון אנשים ברחבי העולם וחסר טיפוליםמרפאים 1. הוא נחשב גם מחלה אוטואימונית, שבה לימפוציטים T אנטיגן מימין ספציפיים ליזום תגובה דלקתית ולהוביל demyelination ופציעה סקסונית ב CNS2. אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE) שימשה באופן נרחב כדי לחקור מנגנונים פתוגנים של טרשת נפוצה כמודל קלאסי מחלת דמיאליציה אוטואימונית ב CNS3. ישנן שתי דרכים לגרום EAE: אחת היא לגרום EAE באופן פעיל על ידי חיסון בעלי חיים עם רכיבים מילין, אחר הוא העברה מאמצת על ידי העברת תאי T encephalitogenic לתוךקולטן 2,,4,,5. הרגישות ל-EAE שונה בזני בעלי חייםשונים 6. בעכברים C57BL/6, מיטלין אוליגודנדרוציט גליקופרוטין (MOG) 35-55 אתגר גורם למחלה monophasic עם demyelination נרחב ודלקת ב-CNS, אשר משמש לעתים קרובות בניסויים עם עכברים ממוקדיםבגן 7.
הדור של תאי T תגובתיים ספציפיים מילין נדרש להתרחשות ופיתוח של מחלה בEAE והוא סימן חיסוני של EAE ו טרשת נפוצה. לימפוציטים T אוטומטי פעיל לחצות את מחסום מוח הדם (BBB) לתוך CNS בריא ליזום מחלת EAE. כאשר MOG 35-55 Ag נתקל, לימפוציטים T אלה לגרום לדלקת וגיוס של תאי אפקט לתוך CNS, וכתוצאה מכך demyelination והרס axon8,9. במודל EAE, יש ראיות רבות כי נוירואנטיגן ספציפי CD4+ T תאים יכולים ליזום ולקיים דלק עצבי ופתולוגיה3,,10. בהתאם ציטוקינים העיקריים המיוצרים, CD4+ T לימפוציטים סווגו לתוך קבוצות משנה שונות: Th1 (מאופיין בייצור של אינטרפרון-γ), Th2 (מאופיין בייצור של interleukin 4), ו Th17 (מאופיין בייצור של interleukin 17). הוא האמין כי ההפעלה של תאי Th1 ו Th17 לתרום אינדוקציה, תחזוקה, ורגולציה של demyelination דלקתי ב EAE ו טרשת נפוצה על ידי הפרשת ציטוקינות effector IFN-γ ו IL-17, אשר מסוגלים להפעיל מקרופאגים וגיוס נויטרופילים לאתרים דלקתיים כדי להאיץ אתהנגעים 11.
בגלל תאי T תגובה אוטומטית לחצות את BBB לתוך CNS ול לגרום להתפתחות המחלה ב-MS ו- EAE, חשוב מאוד לנתח תאי T ב-CNS. עם זאת, יש מעט מאוד פרוטוקולים מבוססים לבידוד של לימפוציטים מ CNS12. לכן, שיטה אופטימיזציה לבידוד תאים חד-נו-קוטריים מהמוח וניתוח לימפוציטים T עם סמנים CD45, CD11b, CD3, CD4, INF-g, ו IL-17 עבור ציתימטריית זרימה פותחה. השיטה משתמשת MOG35-55 adjuvant Mycobacterium שחפת H37 Ra ו פתרון עבודה רעלן Pertussis (PTX) כדי לגרום מודל חיסון פעיל של EAE בעכברים. לאחר מכן, שיטות צנטריפוגציה הדרגתית של הפרדה מכנית ושיפוע צפיפות משמשים לבידוד של תאים חד-נו-נו-קוטביים CNS. לבסוף, אסטרטגיה ממוטבת cytometry gating זרימה משמש כדי לזהות לימפוציטים T ותת קבוצות מהמוח על ידי הכתמת סמנים מרובים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר זה מציג פרוטוקול כדי לגרום ולפקח EAE באמצעות MOG35-55 בעכברים C57BL/6, אשר נחשבים מודל בעלי חיים ניסיוני נוירואימונולוגי טיפוסי של MS. EAE יכול להיות מושרה משתנה זנים עכברים או סוג של חלבון המשמש אינדוקציה על פי מטרת המחקר. לדוגמה, באמצעות PLP139-151 פפטיד בעכברים SJL יכול לגרום קורס מחלת EAE relapsing remitting ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין מענק (31570921 ל ZJ, 81571533 לLS), הוועדה העירונית של שנגחאי לבריאות, ותכנון משפחה (201540206 ל ZJ), Ruijin בית החולים צפון מענק מחקר (2017ZX01 ל ZJ).
Materials
| Alexa Fluor700 anti-mouse CD45.2 | eBioscience | 56-0454-82 | |
| Anti-Mouse CD16/CD32 Fc block | BioLegend | 101302 | |
| APC anti-mouse IFN-g | eBioscience | 17-7311-82 | |
| BD LSRFortessa X-20 | BD | ||
| Dounce homogenizer | Wheaton | 353107542 | |
| eBioscience Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors) (500X) | eBioscience | 00-4975-03 | |
| eBioscience Intracellular Fixation & Permeabilization Buffer Set | eBioscience | 88-8824-00 | |
| FITC anti-mouse CD3 | BioLegend | 100203 | |
| FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400605 | |
| Freund's Adjuvant Complete (CFA) | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| Mouse IgG2a kappa Isotype Control (eBM2a), Alexa Fluor 700, eBioscience | eBioscience | 56-4724-80 | |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra | Difco Laboratories | 231141 | |
| PE anti-mouse IL-17A | eBioscience | 12-7177-81 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD4 | BioLegend | 100422 | |
| PE/Cy7 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400617 | |
| Percoll | GE | 17-0891-01 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD11b | BioLegend | 101228 | |
| PerCP/Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400631 | |
| pertussis toxin (PTX) | Sigma-Aldrich | P-2980 | |
| Rat IgG1 kappa Isotype Control (eBRG1), APC, eBioscience | eBioscience | 17-4301-82 | |
| Rat IgG2a kappa Isotype Control (eBR2a), PE, eBioscience | eBioscience | 12-4321-80 | |
| Rat MOG35–55 peptides | Biosynth International | MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK |
References
- Milo, R., Kahana, E. Multiple sclerosis: geoepidemiology, genetics and the environment. Autoimmunity Reviews. 9, 387-394 (2010).
- Gold, R., Linington, C., Lassmann, H. Understanding pathogenesis and therapy of multiple sclerosis via animal models: 70 years of merits and culprits in experimental autoimmune encephalomyelitis research. Brain : A Journal of Neurology. 129, 1953-1971 (2006).
- Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends in Immunology. 34 (8), 410-422 (2013).
- Lassmann, H., Wisniewski, H. M. Chronic relapsing experimental allergic encephalomyelitis: clinicopathological comparison with multiple sclerosis. Archives of Neurology. 36, 490-497 (1979).
- Bernard, C. C., Leydon, J., Mackay, I. R. T cell necessity in the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. European Journal of Immunology. 6, 655-660 (1976).
- Yasuda, T., Tsumita, T., Nagai, Y., Mitsuzawa, E., Ohtani, S. Experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in mice. I. Induction of EAE with mouse spinal cord homogenate and myelin basic protein. Japanese Journal of Experimental Medicine. 45, 423-427 (1975).
- Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
- Bramow, S., et al. Demyelination versus remyelination in progressive multiple sclerosis. Brain. 133, 2983-2998 (2010).
- Sospedra, M., Martin, R. Immunology of multiple sclerosis. Annual Reviews in Immunology. 23, 683-747 (2005).
- McGinley, A. M., Edwards, S. C., Raverdeau, M., Mills, K. H. G. Th17 cells, gammadelta T cells and their interplay in EAE and multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 20 (14), 3394 (2018).
- Ji, Z., et al. Thiamine deficiency promotes T cell infiltration in experimental autoimmune encephalomyelitis: the involvement of CCL2. Journal of Immunology. 193, 2157-2167 (2014).
- Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121, 44 (2018).
- Ji, Z., et al. Obesity promotes EAE through IL-6 and MCP-1-mediated T cells infiltration. Frontiers in Immunology. 10, 1881 (2019).
- Reiseter, B. S., Miller, G. T., Happ, M. P., Kasaian, M. T. Treatment of murine experimental autoimmune encephalomyelitis with a myelin basic protein peptide analog alters the cellular composition of leukocytes infiltrating the cerebrospinal fluid. Journal of Neuroimmunology. 91, 156-170 (1998).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275 (2014).
- Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. , 11 (2007).
- Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. Journal of Visualized Experiments. (145), e59249 (2019).
